椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是下颈部和背部慢性疼痛的主要病因,同时也是造成脊柱相关残疾的主要原因。因为成因复杂多样,且发生率较高,IDD的治疗或干预方式有限,给病人和整个社会带了巨大的经济和健康负担。造成IDD的主要原因是髓核（nucleus pulposus,NP）细胞过度凋亡和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的降解。同时,NP细胞分泌的炎症因子/促炎因子会加速IDD的病理过程。因此,寻找具有抑制NP细胞凋亡,减少ECM降解和降低炎症反应的药物是治疗或干预IDD的可行方案。酪醇（Tyrosol）是一种多酚化合物,具有保护心脏,抗骨质疏松,抗氧化,抗凋亡和抗炎作用。本研究探讨了酪醇对白介素（interleukin,IL）-1β诱导的人髓核细胞（human nucleus pulposus cells,HNPCs）凋亡,炎症和ECM降解的影响,并揭示了其相应的机制。第一部分酪醇抑制IL-1β诱导的HNPCs凋亡、炎性反应和ECM降解目的:探讨酪醇对IL-1β刺激的HNPCs中IDD进程的影响。方法:1.使用体外培养的HNPCs建立IDD模型。模型组HNPCs用10ng/m L重组人IL-1β刺激48h,实验组HNPCs用终浓度为10μM的酪醇处理48 h,或用终浓度为10μM酪醇和10 ng/m L IL-1β共同处理48 h。2.用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）测定细胞活性;用流式细胞技术测定细胞凋亡情况;用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-aspartic proteases,Caspase）-3/7检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-7活性。用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6、一氧化氮（nitric oxide,NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的含量评估炎症反应的强弱。其中TNF-α和IL-6的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,m RNA）表达量用定量反转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）测定,细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和PGE2的蛋白浓度用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测,NO释放量用Griess反应测量。ECM分解代谢相关基因,包括基质金属蛋白酶-3/9/13（matrix metalloproteinase,MMP-3/9/13）和ECM合成代谢相关基因,包括II型胶原蛋白（collagen type II）、与Y染色体性别决定区相关的高迁移率族蛋白-9（sex determining region Y related high mobility group box protein 9,SOX-9）和蛋白聚糖（aggrecan）的m RNA表达水平同样用q RT-PCR测定。结果:1.CCK-8实验结果表明,浓度在2.5-20μM范围内的酪醇处理48h对HNPCs没有明显的细胞毒性,IL-1β刺激呈剂量依赖性的减少HNPCs的细胞活力,但酪醇能够剂量依赖性的使IL-1β诱导造成的HNPCs活力降低显著回升（P<0.05）;2.流式细胞实验和caspase-3/7活性检测结果表明,IL-1β刺激造成的凋亡率和caspase-3/7活性升高可以被酪醇抑制;3.IL-1β刺激会导致HNPCs中TNF-α和IL-6的m RNA表达量升高,与IL-1β单独处理组比,酪醇与IL-1β共同处理的HNPCs中TNF-α和IL-6的m RNA表达量显著降低（P<0.05）;4.酪醇处理能够显著抑制IL-1β刺激造成NO和PGE2浓度升高;5.IL-1β处理还能够上调ECM分解代谢相关基因如MMP-3、MMP-9以及MMP-13的m RNA水平,降低ECM合成代谢相关基因如II型胶原蛋白、SOX-9和蛋白聚糖的m RNA水平;6.这些IL-1β对ECM相关基因表达量的改变,同样可以被酪醇反转。结论:酪醇抑制IL-1β造成的HNPCs活力减少、凋亡、炎性反应以及ECM降解。第二部分酪醇激活PI3K/Akt通路抑制IL-1β诱导造成的HNPCs凋亡、炎性反应和ECM降解目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）通路在酪醇抑制IL-1β诱导的HNPCs凋亡、炎症和ECM中的作用。方法:1.体外培养的HNPCs分四组:（1）空白对照组;（2）用10 ng/m L IL-1β处理48h;（3）用10μM酪醇和10 ng/m L IL-1β共同处理48 h;（4）10ng/m L IL-1β+10μM酪醇+10μM PI3K抑制剂LY294002共同处理48 h。2.用CCK-8测定细胞活性;用western blot测定Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt,p-Akt）、II型胶原蛋白、SOX-9和蛋白聚糖的蛋白表达量;用流式细胞技术和Caspase 3/7检测实验评估细胞凋亡情况;TNF-α、IL-6、MMP-3/9/13、II型胶原蛋白、SOX-9和蛋白聚糖的m RNA表达量用q RT-PCR测定;上清液中的TNF-α,IL-6和PGE2蛋白的浓度用ELISA检测;NO释放量用Griess试剂测量。结果:1.酪醇处理增加HNPCs中p-Akt的表达量,IL-1β处理降低p-Akt的表达量。酪醇与IL-1β共同处理组中p-Akt的表达量显著高于IL-1β处理组（P<0.05）。但酪醇逆转IL-1β诱导的Akt磷酸化水平降低的作用可以被LY抑制;2.进一步的研究表明,酪醇对IL-1β刺激造成的HNPCs凋亡率和caspase-3/7活性升高的抑制作用也因LY的加入而消失。同时,LY还显著的弱化了HNPCs中酪醇对因IL-1β刺激而升高的TNF-α和IL-6 m RNA表达量以及NO和PGE2分泌量的抑制作用。相似的,LY处理同样弱化了酪醇对IL-1β诱导的HNPCs中MMP-3,MMP-9和MMP-13表达增加以及II型胶原,SOX-9和蛋白聚糖表达减少的影响。结论:1.酪醇能够激活HNPCs中的PI3K/Akt通路。2.酪醇抑制IL-1β造成的HNPCs凋亡、炎性反应以及ECM降解是通过PI3K/Akt信号传导通路发挥作用的。第三部分酪醇通过上调Sirt1激活PI3K/Akt通路,抑制IL-1β诱导造成的HNPCs损伤和ECM降解目的:进一步研究酪醇对IL-1β诱导的HNPCs凋亡、炎症和ECM降解的抑制作用是否通过沉默信息调节因子2同源物1（silent information regulator 2 homolog 1,Sirt1）调控。方法:1.使用Lipofectamine 2000将Sirt1的小干扰RNA（si-Sirt1）或阴性对照小干扰RNA（si-con）瞬时转染至HNPCs进行Sirt1基因敲减。转染后的HNPCs分成四组:si-con组,si-con+IL-1β组,si-con+IL-1β+酪醇组,si-Sirt1+IL-1β+酪醇组.2.用western blot测定Sirt1、Akt、p-Akt、II型胶原蛋白、SOX-9和蛋白聚糖的蛋白表达量;用流式细胞技术和Caspase 3/7检测实验评估细胞凋亡情况;TNF-α、IL-6、MMP-3/9/13、II型胶原蛋白、SOX-9和蛋白聚糖的m RNA表达量用q RT-PCR测定。上清液中的TNF-α,IL-6和PGE2蛋白的浓度用ELISA检测;NO释放量用Griess试剂测量。结果:1.IL-1β处理抑制HNPCs中的Sirt1表达,酪醇处理增加HNPCs中Sirt1的表达。同时,IL-1β对Sirt1表达的抑制作用可以被酪醇处理减弱。无论是否经过IL-1β处理,Sirt1敲减均使HNPCs中Akt的磷酸化减少。2.凋亡实验结果表明,酪醇对IL-1β刺激造成的HNPCs凋亡率和caspase-3/7活性升高的抑制作用因Sirt1敲减而减弱。相似的,Sirt1敲减同样弱化了酪醇对IL-1β诱导的HNPCs中MMP-3,MMP-9和MMP-13表达增加以及II型胶原,SOX-9和蛋白聚糖表达减少的影响。同时,Sirt1敲减还显著的弱化了HNPCs中酪醇对因IL-1β刺激而升高的TNF-α和IL-6 m RNA表达量以及NO和PGE2分泌量的抑制作用。结论:1.IL-1β对Sirt1表达的抑制作用可以被酪醇处理减弱。2.无论是否经过IL-1β处理,Sirt1敲减均使HNPCs中Akt的磷酸化减少,说明Sirt1正向调控Akt通路。3.Sirt1敲减弱化了酪醇对IL-1β诱导的HNPCs的凋亡、炎性反应以及ECM降解的逆转作用。证明酪醇是通过Sirt1调节PI3K/Akt通路发挥其对HNPCs的保护作用。