【摘 要】
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目的探讨Apelin是否通过PI3K-AKT-mTOR信号通路影响苯肾上腺素（PE）诱导的心肌细胞肥大和心肌细胞自噬。方法1.PE诱导建立体外心肌细胞肥大模型,罗丹明标记的鬼笔环肽染色显现心肌细胞骨架,高内涵成像系统分析心肌细胞面积,BCA法测定细胞总蛋白表达水平,RT-PCR技术检测心肌肥大标志物肌球蛋白重链7（MYH7）m RNA的表达,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。2.电穿孔
【基金项目】
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福建省自然科学基金计划项目（基金号:2018J01237）; 2019年创双高火石基金项目（项目编号:2019HSJJ27）
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目的探讨Apelin是否通过PI3K-AKT-mTOR信号通路影响苯肾上腺素（PE）诱导的心肌细胞肥大和心肌细胞自噬。方法1.PE诱导建立体外心肌细胞肥大模型,罗丹明标记的鬼笔环肽染色显现心肌细胞骨架,高内涵成像系统分析心肌细胞面积,BCA法测定细胞总蛋白表达水平,RT-PCR技术检测心肌肥大标志物肌球蛋白重链7（MYH7）m RNA的表达,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。2.电穿孔转染技术,筛选出质粒构建的血管紧张素Ⅰ型受体相关蛋白（APJ）低表达H9C2细胞（Si-APJ）,及其相应空载质粒的稳转细胞（Vector-Si-APJ）。3.实验分组:H9C2细胞、Si-APJ H9C2细胞分别按照干预方式分为对照组、心肌肥大组（PE组）、PE+Apelin组、PE+Rapa组、PE+Apelin+Rapa组。4.蛋白质免疫印迹法检测MYH7、磷酸肌醇3激酶（PI3K）、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）B/A、P62蛋白的表达水平;单丹磺酰尸胺（MDC）染色并通过高内涵成像系统分析细胞染色荧光强度来表示自噬体的改变;罗丹明标记的鬼笔环肽染色心肌细胞骨架并通过高内涵成像系统分析心肌细胞面积;BCA法测定细胞总蛋白表达水平。结果1.浓度梯度法探索PE最佳工作浓度为50umol/L,Apelin最佳工作浓度为10-7mol/L。2.Apelin对PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响:在H9C2细胞中,与PE组相比,PE+Apelin组PI3K、AKT、mTOR磷酸化蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;在Si-APJ H9C2细胞中,与PE组比较,PE+Apelin组PI3K、AKT、mTOR磷酸化蛋白表达减少（P<0.05）。3.Apelin对心肌肥大的影响:在H9C2细胞中,与空白对照组相比,PE组MYH7蛋白、细胞表面积、细胞总蛋白表达增多（P<0.05）;与PE组相比,PE+Apelin组MYH7蛋白表达、细胞表面积、细胞总蛋白明显下降（P<0.05）。在Si-APJ细胞中,与空白对照组相比,PE组的MYH7蛋白相对表达量、细胞表面积、细胞总蛋白明显增加（P<0.05）;与PE组相比,PE+Apelin组的MYH7蛋白相对表达量、细胞总蛋白明显增加（P<0.05）。在H9C2细胞中,与PE+Apelin组相比,PE+Apelin+Rapa组MYH7蛋白表达、细胞表面积、细胞总蛋白表达明显增多（P<0.05）。4.Apelin对心肌细胞自噬的影响:在H9C2细胞中,与空白对照组相比,PE组Beclin-1蛋白相对表达量、MDC染色相对荧光强度明显升高（P<0.05）,P62蛋白相对表达量减少（P<0.05）;与PE组相比,PE+Apelin组Beclin-1蛋白相对表达量、LC3B/A降低（P<0.05）,P62蛋白相对表达量升高（P<0.05）,MDC染色相对荧光强度均减弱（P<0.05）;在Si-APJ H9C2细胞中,与空白对照组相比,MDC染色相对荧光强度增强（P<0.05）;与PE组相比,PE+Apelin组LC3B/A升高（P<0.05）,P62蛋白相对表达量下降（P0.05）。在H9C2细胞中,与PE+Apelin组相比,PE+Apelin+Rapa组心肌细胞LC3B/A明显升高（P<0.05）,P62蛋白相对表达量明显减少（P<0.05）,以及MDC染色相对荧光强度增强（P<0.05）。结论Apelin通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路下调PE诱导的肥大心肌细胞自噬,并且改善PE诱导的心肌细胞肥大。
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