胚胎发生是高等植物发育过程中的一个重要阶段,对这一过程的研究一直是发育生物学的焦点。正常情况下,胚胎发生沿着固定的模式进行,中间的很多发育事件都是可以预测的。该过程在时间和空间上都被严格调控,涉及一系列基因的顺序表达和信号传导。胚胎发生领域的研究,对于揭示高等植物的基因调控机制有着重要意义。胚胎发生过程中一个重要事件就是合子的不均等分裂形成了顶细胞和基细胞,这两个细胞拥有截然不同的形态学特征和发育命运。有人推测是由于合子中包含的细胞命运决定子在两个子细胞中的不均等分布,或者是两个细胞不同的转录谱决定了顶基细胞截然不同的命运。然而,这些假设都没有可靠的证据支持。而顶、基细胞转录谱的比较研究对于揭示顶基细胞命运决定机制奠定了基础。由于高等植物的胚胎被包裹在胚珠组织中,难以获得,人们对于早期胚胎的转录本还知之甚少。我们成功分离得到了烟草二胞原胚的顶、基细胞,分别建立了cDNA文库,通过随机挑选克隆测序,获得了关于顶、基细胞转录谱的重要信息。并通过检测一些基因在顶细胞、基细胞、合子中的表达水平,对顶、基细胞的发育命运决定机制进行了探讨。主要实验结果如下：1.通过酶解-研磨法分离到二胞原胚以后,再利用激光切割破坏其中一个细胞,从而收集到单独的顶、基细胞。在溶液中加入RNA合成抑制剂(?)ictinomycinD和cordycepin,以避免应激反应所产生的新转录本。分离后对得到的顶、基细胞采用FDA染色,结果表明细胞活性良好。我们以72个顶细胞、88个基细胞为材料,采用SMART cDNA Library Construction Kit分别成功构建了cDNA文库。顶细胞cDNA文库滴度为2.5x106pfu ml-1,基细胞cDNA文库滴度为2x106pfum1-1。通过蓝白斑数量计算,顶、基细胞cDNA文库重组率均高于99%。从随机挑选的噬菌斑上用PCR检测插入片段的长度分布情况。顶细胞cDNA文库中插入片段长度在0.3-1.7kb,平均长度为0.6kb。基细胞cDNA文库中插入片段长度在0.3-1.7kb,平均长度为0.5kb。这是首次以植物二胞原胚的顶、基细胞为材料构建cDNA文库,为研究顶、基细胞的转录谱奠定了基础。2.从顶、基细胞cDNA文库中分别随机挑取克隆,以5’sequencing primer作为引物进行测序。去除载体序列和低质量序列以后,从顶细胞cDNA文库获得2772条EST,基细胞cDNA文库中获得2776条EST。EST聚类后,顶细胞中得到2072条Cluster,基细胞中得到1950条Cluster。顶、基细胞的高丰度转录本组成大部分相同,表达量最高的cluster中,同样包括核糖体蛋白、分子伴侣、泛素、钙调素、组蛋白等。在顶、基细胞EST的功能分类中,各分类所占比例相似,同样是蛋白质合成、蛋白质命运、转录、细胞周期与DNA处理、代谢等分类所占比例较高。通过以上对顶、基细胞的EST进行对比分析,揭示了顶、基细胞的转录谱没有所期待的明显差异。但确实存在着一些参与胚胎发生调控的重要基因的差异表达,这可能是顶基细胞发育命运不同的分子基础。3.我们从顶基细胞EST中选出一批候选基因,采用RT-PCR来检测其在顶、基细胞中的表达水平,找到了两个基细胞特异表达基因。随后采用更精确的qPCR方法,找到了一批在顶基细胞中表达量有显著差异的基因,以及两个在顶细胞中特异表达的基因。证实了顶、基细胞在转录水平上的差异,并为后续对顶基细胞命运决定机制的研究提供了切入点。4.将顶基细胞EST与合子EST比较分析,发现了很多两者共有的EST。通过qPCR检测这些EST在合子中的表达水平,发现上述差异表达基因中大部分都从合子继承而来,但那两个特异在项细胞表达的基因并不在合子中表达。证实了合子中的转录本通过合子不等分裂被不均等分配到顶、基细胞；此外,合子分裂以后还出现了特异在顶细胞中新转录的基因。这可能是顶基细胞存在差异表达基因转录本的主要原因。5.利用RACE获得contig500的cDNA全长,再通过蛋白质序列比对找到拟南芥中的一系列高度相似的基因。这些基因都属于拟南芥MAN家族,其中AtMAN7与contig500的蛋白序列最接近。于是我们克隆了拟南芥MAN家族各基因的启动子,构建了启动子GUS载体以研究各个启动子的活性。还构建了MAN基因的过表达、amiRNA载体,获得相应的转基因植株,并对AtMAN7基因的功能进行了初步研究。