猪圆环病毒2型(PCV2)是一种无囊膜的环状负链DNA病毒,感染猪后可以造成淋巴结肿大、免疫机能下降、渐进性消瘦等病理变化。PCV2所引发的疾病中以断奶仔猪多系统衰竭综合症最为严重,该疾病主要危害5-18周龄的仔猪,具有高致病性和高死亡率。然而,猪圆环病毒病(PCVD)在各个国家和地区的发病率和严重程度都有很大差异。据报道,混合感染、免疫刺激、饲养管理等因素都能影响PCV2的复制和PCVD的发病情况,但是PCV2的复制机制及致病机理仍不完全清楚。H202是一种常用的氧化刺激剂,在需氧细胞中,H202、O2-、-OH等共同构成了活性氧簇(ROS)。自噬是真核细胞中将需要降解的的成分通过溶酶体途径分解代谢,以维持细胞环境稳定的一个过程。细胞自噬与病毒感染具有密切的关系,一方面细胞可以通过自噬隔离病毒以防止扩散,并介导免疫系统以清除病毒;另一方面指很多病毒演变出逃避机制,利用自噬来躲避免疫系统的清理并促进自身在细胞中的复制。近年来研究发现,H202处理或PCV2感染引起的自噬都可促进PCV2的复制,但具体的作用机制仍不完全清楚。本论文主要探讨了 H202对PCV2体外复制的影响及其自噬机制,以期为PCV2的复制机制和致病机理的进一步研究提供依据。试验一:H2O2对猪圆环病毒2型体外复制的影响在PCV2感染PK-15细胞12小时后,用不同浓度的H2O2(0、10、50、100 μM等)处理,作用48小时后进行MTT、Real-time PCR和免疫荧光试验。结果显示,10、50、100μM的H2O2对PK-15细胞的活力无显著影响,只有在200 μM和400 μM的高浓度下才可以引起细胞损伤;10、50、100 H2O2处理后PCV2 DNA拷贝数和PCV2感染阳性的细胞数显著增加,表明H202可以促进PCV2在PK-15细胞中的复制。另外,我们还研究了 H202对PCV2感染的PK-15细胞氧化还原状态的影响,结果显示,PCV2感染后GSH浓度显著降低、ROS水平显著升高,诱导PK-15细胞发生氧化应激,且H202加重PCV2对宿主细胞的氧化应激。试验二:H202促进猪圆环病毒2型体外复制的自噬机制为了探讨H202对PK-15细胞自噬的影响,在不同浓度的H202(0、10、50、100μM)处理PK-15细胞48小时后,用Western Blot检测细胞中自噬蛋白LC3的含量,并设立自噬诱导剂Rapamycin处理组作为阳性对照、未处理组为阴性对照;同时,我们选取H202浓度为50 μM,处理PK-15细胞48小时后观察GFP-LC3分布情况并制作超薄切片观察超微结构。结果显示,与未处理组相比,H202处理后PK-15细胞中的LC3-Ⅱ的表达量显著增高,GFP-LC3呈点状聚集,且在透射电子显微镜下可以看到与Rapamycin处理组类似的自噬囊泡样结构增多,表明H202促进PK-15细胞的自噬。为了探讨H202促进PCV2在PK-15细胞中复制的自噬机制,添加3-甲基腺嘌呤(3-MA)或转染siATG5用于研究。结果显示,与对照组相比,3-MA或siATG5抑制自噬后,PCV2 Cap蛋白表达量、DNA拷贝数、PCV2 阳性细胞数显著降低,表明自噬抑制后阻断H202对PCV2复制的促进作用。