家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表物种,是人类经过长期驯化而得来的重要经济昆虫之一,有着良好的科学研究基础,是探索昆虫免疫防御机制、病原互作机制的重要模式生物。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是研究和应用最多的病原真菌之一,能够引起家蚕等经济昆虫白僵病的发生,给蚕桑产业等经济昆虫产业带来了重大的经济损失。与此同时,球孢白僵菌因其寄主范围广泛、致病性较强、适应性较强、兼容性较强以及制备和应用操作简便等优点,被认为是最好的生物防治菌种,广泛应用于农林产业害虫的防治过程。本研究以球孢白僵菌为病原,以家蚕为宿主昆虫,分别从病原侵染机制、病原致病机制和昆虫防御机制等三个方面阐释了白僵菌与家蚕的互作机制,取得如下主要结果。一、球孢白僵菌对家蚕的侵染机制体壁感染是球孢白僵菌侵入寄主昆虫的主要方式,胞外水解酶在体壁感染中起到重要作用。本文检测了11株白僵菌对家蚕的侵染毒力、胞外蛋白酶和胞外几丁质酶酶活力及相关基因的表达水平,并通过统计分析软件分析了胞外蛋白酶和几丁质酶活性与白僵菌对家蚕侵染毒力的关系;检测了蛋白酶和几丁质酶抑制剂对侵染毒力的影响;应用酵母表达系统表达了白僵菌昆虫体壁降解蛋白酶(BbCDEP1)并测定了该酶对家蚕体壁的降解作用。实验结果表明,不同菌株的孢外蛋白酶活力和Bbcdep1的表达水平与半数发病时间(MMT)和半数致死时间(LT50)均呈显著负相关关系,拟合方程符合阻滞生长方程(Logistic equation)模型,而蛋白酶抑制剂实验也证明白僵菌胞外蛋白酶抑制之后明显降低了侵染毒力;蚕皮冻干粉诱导之后,不同菌株的Bbcdep1表达水平显著提高,但上调倍数差异显著;蚕体实验表明,白僵菌侵染家蚕之后,Bbcdep1仅在侵染前期上调表达,与孢子萌发时间相符合;酵母系统表达的BbCDEP1蛋白能高效降解家蚕体壁组织,其降解能力相当于50%的蛋白酶K的活性。另外,统计分析结果表明,白僵菌菌株之间几丁质酶活力的差异不显著,而且胞外几丁质酶活性与毒力的统计学相关性也不显著;但是用抑制剂抑制几丁质酶活性后,白僵菌的毒力明显下降;定量PCR结果表明两种白僵菌几丁质酶基因(Bbchit 1和Bbchit2)在蚕皮粉诱导下上调表达模式不同,Bbchit 1在各菌株均上调表达,而Bbchit 2仅在部分菌株中上调表达,但是在白僵菌侵染家蚕过程中,Bbchit 1和Bbchit 2在孢子萌发和体壁穿透过程中均上调表达,而且Bbchit 2在白僵菌感染家蚕后期显著上调表达,说明Bbchit 2可能参与了后期的致死过程。以上结果说明,白僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶是白僵菌侵染家蚕的重要毒力因子,但是它们的表达模式差异显著;bbcdep1可以作为毒力改造的目标基因,而bbcdep1也可以用于生物蛋白酶制剂的开发和利用;白僵菌胞外几丁质酶不仅参与侵染过程,还参与后期的致病过程,其具体机制还有待进一步深入研究。二、球孢白僵菌对家蚕的致病机制病原真菌通过营养竞争、分泌真菌毒素和破坏氧化还原平衡而最终导致宿主昆虫死亡。我们提取了白僵菌毒素并检测了毒素对家蚕幼虫的存活率和bmn细胞的影响;用实时定量pcr的方法检测了白僵菌侵染家蚕之后家蚕糖代谢酶系和抗氧化酶系相关基因表达量的变化;此外,我们还检测了白僵菌侵染家蚕之后总抗氧化能力、sod、和cat活性的变化以及添加外源抗氧化剂对白僵菌毒力的影响。实验结果表明,白僵菌毒素能够显著降低家蚕幼虫的存活时间,而且能够使家蚕细胞发生凝集作用并最终崩解死亡。白僵菌侵染家蚕之后,糖代谢酶系相关基因显著下调表达,说明白僵菌能够影响家蚕糖代谢水平,破坏家蚕能量代谢。此外,白僵菌侵染家蚕之后,总抗氧化活力、sod和cat酶活性显著下降,抗氧化酶系相关基因表达水平在感染后期显著降低,而添加外源sod和cat等抗氧化剂能显著提高家蚕的存活时间,说明白僵菌侵染家蚕后会破坏家蚕体内的抗氧化平衡。以上结果说明,白僵菌通过分泌毒素、破坏家蚕的能量代谢和抗氧化平衡最终导致家蚕死亡,但具体的作用机制还要进一步探索。三、家蚕对白僵菌感染的免疫防御机制昆虫的先天性免疫防御体系是抵抗病原微生物入侵的重要屏障。不同的病原会激活不同的免疫信号通路和免疫效应因子而引起不同的免疫反应。本实验通过实时定量的方法检测了家蚕感染白僵菌后toll信号通路、imd信号通路、jak/stat信号通路和黑化作用相关基因,以及抗菌肽(amps)等效应因子的表达水平;通过rnai的方法分析了toll信号通路和jak/stat信号通路的信号传递机制;检测了信号通路特异的抑制剂抑制信号传递后对家蚕幼虫存活率和血淋巴抗真菌活性的影响;用原核表达系统表达了家蚕抗菌肽,并测定了其对白僵菌的抗菌活性。实验结果表明,白僵菌侵染家蚕之后,能够激活toll信号通路、imd信号通路、jak/stat信号通路和黑化作用,导致相关信号因子表达水平的改变,但是各信号因子在白僵菌感染家蚕的不同时期表达水平差异显著。bmβgrprnai干扰实验表明,家蚕中可能存在两条toll信号子通路:bmβgrp1-bmtoll3–bmtoll6–bmtoll9-bmspaetzle–bmgloverin2和bmβgrp2orbmβgrp3–bmtoll7-bmlysozyme,它们在抗白僵菌侵染过程中可能起到重要作用。家蚕感染白僵菌后,bmpgrp-lc、bmdredd、bmfadd、bmtak1和bmrelish1在不同的感染时期显著上调表达,而bmrelish2却显著下调表达,说明白僵菌入侵能够激活家蚕的imd信号通路,但可能主要通过bmrelish1调控靶基因的转录、表达。家蚕感染白僵菌后,bmctl5、bmhop、bmstat均显著上调表达,已知的jak/stat信号通路负调控因子bmsocs2、bmsocs6和bmken则显著下调表达,而另一个调节基因——bmdrk则显著上调表达,说明白僵菌侵染家蚕也能激活jak/stat信号通路;不同病原感染实验也表明,jak/stat信号通路只能被白僵菌所激活,而不能被lps和bmcpv激活;此外,bmctl5rnai干扰实验证明bmctl5可能是jak/stat信号通路的重要模式识别受体。家蚕感染白僵菌后,10种bmserpin表达模式差异显著,bmserpin1、bmserpin5、bmserpin7、bmserpin8和bmserpin10在白僵菌感染的不同时期下调表达,预示它们可能参与到丝氨酸级联反应的调控,激活黑化作用等免疫反应;bmserpin2、bmserpin3、bmserpin4、bmserpin6和bmserpin9在整个感染过程中上调表达,我们推测它们可能通过抑制白僵菌丝氨酸蛋白酶——bbcdep的活性,来提高家蚕的抗真菌活力。另外,酚氧化酶活化级联反相关基因在白僵菌侵染家蚕的整个过程中都显著上调表达,说明白僵菌侵染家蚕会引发家蚕强烈的黑化反应,也进一步说明了黑化作用在昆虫抗真菌免疫中起到重要作用。抗菌肽是昆虫先天性免疫反应的直接效应因子。家蚕感染家蚕感染白僵菌后bmmoricin1、bmdefencin、bmgloverin2、bmlysozyme、bmcecropina、bmcecropinb、bmattacin、bmlebocin1均显著上调表达,而抑菌活性实验表明,只有bmcecropina、bmcecropinb和bmattacin三种抗菌肽对白僵菌有明显的抑制作用,推测其它抗菌肽的上调表达可能是由于白僵菌主动调控家蚕抗菌肽的表达,以抑制其它杂菌的生长,以保护自己的营养和寄生需求。为进一步分析家蚕幼虫解毒和抗氧化防御系统在球孢白僵菌侵染过程中的作用,我们检测了家蚕幼虫感染球孢白僵菌以及注射球孢白僵菌毒素之后血淋巴、中肠和脂肪体中gsts酶活力、gsh-px酶活力、gr酶活力、gsh含量及其基因表达水平的变化,同时还检测了注射gsh和毒素对家蚕幼虫感染球孢白僵菌后存活率的影响。实验结果表明,家蚕感染白僵菌后脂肪体、中肠、血淋巴中的gsts、gr、gsh-px酶活力显著提高,各组织中bmgstd1、bmgsts1、bmgsto1和bmgsh-px的表达量在感染后期也显著上调表达,而gsh含量却急剧下降,说明家蚕幼虫可以通过增加酶活力并上调解毒和抗氧化因子的表达量以增强抗真菌感染能力。毒素注射实验表明家蚕幼虫对球孢白僵菌毒素的解毒作用主要在脂肪体和血淋巴中依赖gsts、gr和gsh来完成,同时定量实验表明bmgsts1和bmgsto1在注射毒素24h后显著上调表达,说明它们可能是家蚕幼虫对球孢白僵菌毒素的主要解毒基因。存活率实验结果表明gsh能够缓解球孢白僵菌毒素对蚕体的损害,延长家蚕幼虫的半数致死时间(约6h)。以上结果说明,家蚕幼虫GSTs和GSH-Px构成的解毒和抗氧化防御系统在抗真菌感染过程中起到重要作用。本文取得的研究成果,为家蚕抗性品种的培育、新型抗真菌药物和新型生防制剂的研发提供了重要的科学依据。