氮作为生物生长必不可少的大量营养元素之一,不仅影响着地面植被的生长繁殖和初净生产力,也对土壤营养和微生物群落结构及功能具有重要作用。由微生物驱动的氮循环已成为人们研究物质循环和生态环境及气候变化的热点之一。青藏高原因其独特的自然环境和生态屏障功能成为我国畜牧业可持续发展和环境保护的基础。然而,由于自然变化和人为不合理的利用,导致高原草地生态系统严重退化,对当地生态环境的稳定和畜牧业的健康发展构成严重威胁。已有大量文献报道了青藏高原自然条件和不同人为管理模式下的氮循环与地面植被的相互作用关系,而不同管理模式对土壤中自生固氮微生物的影响却鲜有报道。本研究以青藏高原东部甘南藏族自治州玛曲县的高寒草甸生态系统为试验对象,采用构建功能基因(nifH)克隆文库和实时荧光定量PCR技术相结合的方法,探讨了长期不同施肥量(0、30、60、90、120g.m 2·year-1)和放牧强度(全年禁牧、季节性放牧和四季放牧)对自生固氮微生物群落结构及丰度的影响,揭示了固氮微生物与土壤理化性质间的相互关系,为高寒草甸的管理和保护提供理论支持。主要结果如下:1.长期施肥对自生固氮微生物群落结构和nifH基因丰度影响采用构建基因克隆文库研究自生固氮微生物群落结构的结果显示:构建的15个文库里的nifH基因序列属于9个Cluster,即Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaptoteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes、Actionbacteria、Archaeal 和不可培养的 Unidentified Cluster。每个Cluster在不同处理样品中分布不均,且在不同施肥浓度的土壤中,其优势Cluster也不同。在FO-F120的样品中,不可培养细菌都是最主要的类群,占总克隆文库丰度的42.00～61.33%,F30中含量最低而F120中最高。从可培养细菌在不同处理中的分布来看,4种Proteobacteria相比其他4种菌群的分布更广,丰度更高。从Shannon-weaver指数来看,所有文库的指数值都在2.10以上,F60(2.14)最低,F120(2.84)最高。固氮微生物具有较高的多样性,从F0到F120有逐渐增加的趋势,但并不显著。基于nifH基因的实时荧光定量PCR结果显示:施肥引起了土壤中自生固氮微生物nifH基因丰度显著下降。基因拷贝数在3.15×106-7.76×106copies g-1 dry soil之间,且随着施肥浓度的增加,基因拷贝数呈显著(p<0.05)下降的趋势。F120基因拷贝数比F0少了 59.4%。2.放牧强度对自生固氮微生物群落结构的影响基于系统发育树,所有OTU的基因序列被划归到5个Cluster,即Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes和不可培养的Unidentified Cluster。Cluster以不同的比例在G1、G2和G3中都有分布,且随着放牧强度的增加,其变化趋势不同,但不显著。Alphaproteobacteria和不可培养的Unidentified Cluster的丰度逐渐增加,而Firmmicutes则逐渐减少,Betaproteobacteria和Cyanobacteria 都呈减少的趋势。3.施肥处理的自生固氮微生物群落结构和丰度与土壤理化因子之间的关系不同施肥处理下自生固氮微生物群落与土壤理化因子的Mantel检验结果表明,pH(p=0.009)、硝态氮(p=0.007)、可利用氮(p=0.030)和可利用氮磷比(p=0.028)是影响微生物群落结构的主要因素。可利用磷(p=0.076)对群落结构的影响具有边缘显著效应,而其他理化因子则影响不大。Pearson相关性分析自生固氮微生物nifH基因丰度与土壤理化因子的相关性结果表明:硝态氮(p=0.030)、可利用氮(p=0.022)、可利用磷(p=0.015)和可利用氮磷比(p<0.01)对基因丰度具有显著或极显著的影响。同时,硝态氮(1=-0.559)、可利用氮(r=-0.584)和可利用磷(r=-0.615)与丰度具有显著的负相关性,而可利用氮磷比(r=0.830)对丰度具有极显著的正相关影响。4.放牧处理的自生固氮微生物群落结构与土壤理化因子之间的关系NMDS结果显示土壤理化因子是引起群落结构差异的主要因素。pH(r2=0.654,p=0.045)和可利用磷(r2=0.764,p=0.017)是影响自生固氮微生物群落结构变化的主要因子。综上所述,长期施肥和放牧强度均改变了自生固氮微生物的群落组成和多样性,而长期施肥也显著改变了固氮微生物的丰度。土壤理化因子对微生物的群落结构和丰度有显著的影响。