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目的女贞子(Fructus Ligustri Lucidi)最早记载见于《神农本草经》,具有滋补肝肾,明目乌发的功效。历代本草文献记载和现代临床应用都表明,女贞子具有治疗骨质疏松的作用。Wnt/β-catenin信号可以通过促进β-catenin与下游基因的转录,参与骨重建,促进成骨细胞的形成,抑制破骨细胞,维持骨吸收与骨形成的动态平衡。但是女贞子是否是可通过Wnt/β-catenin信号发挥预防和治疗骨质疏松的作用,目前尚不清楚。本研究将探索女贞子对 DKK1、β-catenin、Active-β-catenin、GSK3β、P-GSK3β(Ser9)、OPG、IGF-1蛋白的调节,从而激活经典Wnt信号通路,促进成骨细胞的形成,发挥预防和治疗骨质疏松。方法本实验通过切除大鼠的卵巢,建立骨质疏松模型,将造模成功的大鼠,分为三组:模型(OVX)、阿伦膦酸钠(ALN)、女贞子水提液(FLL),假手术(SHAM)大鼠仅切除卵巢四周的一小块儿脂肪,作为对照组。FLL给予女贞子水提液(3.5g/kg),ALN给予阿伦磷酸钠混悬液(0.12g/kg),OVX和SHAM给予等体积的去离子水,连续灌胃12周,每周测大鼠的体重;实验结束时,统计大鼠的脏器指数;用生化分析法测大鼠的钙磷代谢和血脂代谢,如:血清和尿液中的钙(Ca)和磷(P),尿肌酐(Cr),血清高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量;用ELISA法测大鼠血清和尿液的骨转换标志物,血清I型胶原氨基端前肽(PINP)和尿脱氧吡啶林(DPD)的含量;用放免法测定骨形成标志物血清碱性磷酸酶(ALP)含量;利用Discovery Wi双能X线(DXA)骨密度仪的小动物成像软件,测股骨、第二、四、五腰椎骨的骨密度;利用Micro-CT,测股骨近端骨小梁微结构参数;通过进行三点弯曲实验,测股骨的最大载荷、最大应力和弹性模量;HE染色,观察股骨组织骨小梁的结构和形态;茜素红染色,观察股骨成骨细胞的钙化结节的分布;Safranin O/Fast-Green染色,观察钙化骨和软骨糖胺聚糖的含量和分布。利用免疫组化法,免疫荧光法或Western Blot法观察Wnt/β-catenin信号通路的上游蛋白,如DKK1、OPG和IGF-1蛋白及成骨细胞活性标志物ALP蛋白的表达;同时,观察下游蛋白,如β-catenin、Active-β-catenin、GSK3β和P-GSK3β的蛋白表达。结果女贞子水提液可以抑制去卵巢引起的大鼠体质量上升,但是对脏器指数无明显影响;升高血清中Ca、P、HDL和PINP的含量,降低尿U-Ca/Cr和U-P/Cr的比率;同时,降低血清中TC、TG、LDL、ALP和尿液中DPD的含量(P<0.01,0.05),从而调节骨代谢、脂代谢、胶原代谢,降低骨转换率;增加去卵巢大鼠股骨和椎骨的骨密度,改善股骨的微观结构,增加骨强度;改善骨小梁的结构形态,增加钙化结节和糖胺聚糖的分布。升高骨源性ALP蛋白的表达量,促进成骨细胞的形成,治疗骨质疏松。进一步研究表明,女贞子水提液可以通过增加Wnt/β-catenin信号的P-GSK3β(Ser9)、OPG、β-catenin和IGF-1蛋白的表达,降低GSK3β、DKK1、Active-β-catenin蛋白的表达量,激活Wnt/β-catenin信号,促进成骨细胞的分化和成熟,促进骨形成。结论1.女贞子能升高去卵巢大鼠的骨密度,改善骨微结构,提高骨强度,从而预防和治疗骨质疏松;2.女贞子治疗骨质疏松的作用机理之一在于调节钙磷代谢,胶原蛋白和脂代谢;3.女贞子水提液改善骨质疏松的分子机制可能是通过上调OPG、IGF-1、P-GSK3β(Ser9)和 β-catenin 蛋白,下调 GSK3β、DKK1、Active-β-catenin 蛋白,激活 Wnt/β-catenin 信号,促进骨形成,抑制骨吸收,从而治疗骨质疏松。