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目的:临床上最为常见的食管发育畸形是食管闭锁合并食管气管瘘(EA/TEF),其是在新出生婴儿食管发育畸形中发病率较高。尽管大部分EA/TEF患儿可以通过手术成功校正。但术后会出现多种并发症,如胃食管反流、肺炎、频繁咳嗽等。因此研究食管闭锁疾病的发生过程,阐明发病机制,有重要的临床意义,可对该疾病的预防、诊断以及治疗起到积极作用。查阅文献发现前肠发育畸形与Noggin、Sox2、Nkx2.1、β-catenin等基因密切相关。因此,Sox2、Nkx2.1等基因成为研究先天性EA/TEF疾病发生的重要研究靶标。14-3-3s蛋白是一种在细胞内发生磷酸化作用的重要因子,其参与多种生命活动的调节过程,我们之前的研究显著显示其与正常食道组织相比,在先天性EA/TEF患儿食道组织中14-3-3β的mRNA与蛋白明显上调。故本文以正常人食管上皮细胞(HEEC)为研究对象,研究14-3-3β与Sox2之间的相互作用,以及14-3-3β对Sox2下游靶基因的影响,最终阐明14-3-3β与Sox2在先天性EA/TEF疾病中的分子调节机制。方法:1.HEEC细胞内源性14-3-3β和Sox2表达的检测:培养HEEC细胞至融合度达80%~90%,收集细胞,分成两份,分别采用RT-PCR和Western blot方法在mRNA水平和蛋白水平检测14-3-3β和Sox2的表达情况;2.14-3-3β稳定下调转基因细胞的建立:利用基因工程技术和病毒包装技术构建14-3-3β-shRN重组慢病毒载体,然后将病毒感染HEEC细胞。实验分组为:(1)常规培养之HEEC细胞;(2)阴性对照HEEC转基因细胞;(3)14-3-3β下调HEEC转基因细胞。用荧光显微镜观察病毒感染效率,RT-PCR和Western blot检测14-3-3βmRNA水平和蛋白质的表达情况。3.Sox2基因稳定过表达的HEEC细胞制备:利用基因工程技术和病毒包装技术构建Sox2重组慢病毒载体,然后将病毒感染HEEC细胞。实验分组为:(1)常规培养之HEEC细胞;(2)阴性对照HEEC转基因细胞;(3)Sox2高表达HEEC转基因细胞。用荧光显微镜观察病毒感染效率,RT-PCR和Western blot检测Sox2 mRNA水平和蛋白质的表达情况。4.机制分析:利用RT-PCR或Western blot检测Noggin、Sox2、Nkx2.1、β-catenin等基因的表达。CCK8实验检测14-3-3β下调或Sox2过表达对HEEC细胞增殖的影响。结果:1.正常人食管上皮细胞(HEEC)能检测到14-3-3β基因的mRNA及蛋白表达,但Sox2的表达水平较低。2.成功构建了14-3-3β稳定下调转基因细胞和Sox2稳定过表达转基因细胞。3.14-3-3β的干扰对Sox2下游基因没有显著性的影响;Sox2的过表达对HEEC细胞增殖的影响没有显著性差异。结论:本课题完成了14-3-3β稳定下调转基因细胞和Sox2稳定过表达转基因细胞的构建,并发现HEEC细胞14-3-3β具有高水平的表达,以及Sox2低水平的表达。下调14-3-3β的表达对Sox2下游基因没有显著性的影响;Sox2的高表达对HEEC细胞增殖的影响没有显著性差异。