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生长激素(Growth hormone,GH)是由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的一种单链蛋白质类激素,具有广泛的生理作用,影响动物机体蛋白质、脂肪和糖的代谢,与生长发育、繁殖等密切相关。
通过应用RT-PCR、RACE、克隆测序等技术首次克隆得到乌龟(Mauremysreevesii)GH基因全长cDNA序列,并对其序列结构、氨基酸组成以及蛋白性质进行了初步分析。填补了爬行动物GH研究的空白,为进一步研究各种爬行动物的GH基因奠定基础,对今后爬行动物GH基因的表达调控、基因多态性及其与寿命、生长速度、生产性能相关性及进化等方面的研究起着促进作用。主要研究结果如下:
1.根据NCBI登录的鸟类、哺乳类、两栖类以及鱼类四个纲20种动物的GH基因全长cDNA序列,在其保守区域内设计引物,利用RT-PCR技术扩增得到乌龟GH基因部分序列。然后在已得到的序列中设计特异性引物,用RACE方法快速获得乌龟GH基因5、3末端cDNA序列。并拼接获得乌龟GH基因全长791 bp的cDNA序列(登录号:EF424785)。经分析:乌龟GH基因mRNA序列包括66 bp的5UTR,654.bp的ORF,71bp的3UTR。在ORF后有典型的加尾信号5AATAAA 3,GH基因编码217个氨基酸(登录号:AB009819.1)。
2.应用生物信息学对乌龟GH基因全长cDNA序列以及编码的氨基酸序列进行分析表明,乌龟GH基因编码区碱基序列与鸟类具有很高的同源性,与鸵鸟、鸭、鸡、鹅、火鸡的GH基因cDNA的同源性依次为85.0%、83.4%、83.4%、83.3%、82.5%;另外,与马、小鼠、牛蛙、鲟鱼、人的GH基因cDNA的同源性依次是74.8%、72.5%、70.2%、65.9%、64.1%。该基因编码的氨基酸序列与其它动物也具有很高的同源性,与同属于爬行动物的鳄鱼和绿海龟的同源性达到99.0%和92.6%;其次,与鸵鸟、鸭、鸡、鹅、火鸡、马、小鼠、牛蛙、鲟鱼、人的同源性分别为86.2%、84.7%、83.3%、84.7%、81.0%、77.3%、75.0%、68.9%、71.0%、53.5%,在分子进化上十分保守;乌龟GH基因碱基序列的同源性与氨基酸序列的同源性基本一致。
3.对乌龟GH的蛋白质性质分析得出:乌龟GH蛋白质分子质量约为24.86 kDa,等电点pI为7.78,第15个氨基酸位置有一个最大的疏水性位点,分值为3.200,并存在明显的跨膜区域。应用神经网络算法和隐马氏模型分析结果显示该肽链信号肽位置为1-26,断裂点位置是26-27(GAA-AF)。从而得出,乌龟GH的氨基酸包括长度为26个氨基酸的信号肽和191个氨基酸成熟肽。