论文部分内容阅读
三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]为人参属药用植物,具有悠久的药用历史。三七皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是三七主要的活性成分,在防治心脑血管疾病方面作用显著。由于三七药材为多年生植物,种植需要轮作,土地利用率低,因此有必要深入研究三七皂苷的生物合成调控技术,为利用合成生物学生产药用皂苷提供理论依据和技术基础。三七皂苷主要由甲羟戊酸(MVA)途径合成,该皂苷合成途径中,存在植物甾醇副产物合成支路,分流皂苷合成代谢流。因此,植物甾醇合成支路的第一个关键酶“环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)”虽然不直接影响三七皂苷的合成,但由于它与达玛烯二醇合成酶(dammarenediol-II synthase,DS)共享合成皂苷的前体2,3-氧化鲨烯(2,3-oxidosqualene),因此通过调控CAS表达,可以间接影响皂苷的合成。此外,我们的前期研究表明转录因子能够影响直接参与三七皂苷合成的关键酶基因的表达,进而实现对皂苷合成代谢流的调控。本研究利用转录因子独有的“多点调控”优势,同时结合副产物支路的弱化调节,力图最大程度地提高三七皂苷的生物合成效率。论文根据已知三七PnbHLH转录因子基因序列构建pCAMBIA1300S-PnbHLH植物过表达载体,并实现该转录因子在CAS RNAi三七细胞中的过表达,探讨PnbHLH与CAS RNAi协同作用对三七皂苷生物合成的调控。研究首先克隆了三七转录因子基因PnbHLH,其开放阅读框长为966 bp,编码321个氨基酸。同源序列比对和系统进化树分析表明PnbHLH转录因子属于bHLH类转录因子家族。将目的基因PnbHLH与过表达载体pCAMBIA1300S连接获得重组载体pCAMBIA1300S-PnbHLH,并通过冻融法将其导入农杆菌EHA105中,利用农杆菌侵染法将含有PnbHLH片段的T-DNA整合到含有CAS干扰片段的三七细胞基因组中。经过几轮双抗生素筛选及抗性基因(npt II和hpt II)PCR检测,成功获得PnbHLH/CAS阳性细胞系。荧光定量PCR结果表明,PnbHLH基因在含有CAS RNAi片段的三七细胞中成功实现过表达,选取其中四株PnbHLH/CAS阳性三七细胞系用于后续研究,分别编号为T1、T2、T3和T4。三七总皂苷检测结果表明,四株PnbHLH/CAS阳性三七细胞系的皂苷含量与野生型对照组(WT)和含有CAS RNAi片段(Ti)的对照组相比均有明显提升,植物甾醇含量与Ti相比明显下降。结果表明在三七细胞中过表达PnbHLH基因能够提高皂苷的合成量;CAS基因的RNAi可使副产物支路合成的植物甾醇含量降低,与过表达PnbHLH协同作用会间接提高三七皂苷合成支路的代谢流。采用高效液相色谱法(HPLC)检测三七细胞系中主要单体皂苷的含量,发现与对照组相比,转基因细胞系中五种单体皂苷(Rd、Rb1、Re、Rg1和R1)含量均有不同程度提高,且qPCR结果表明dammarenediol-II synthase(DS)、squalene synthase(SS)和squalene epoxidase(SE)等直接参与三萜皂苷合成的关键酶基因表达量相对于WT以及Ti细胞来说均有升高。为明确三七转录因子PnbHLH在三七皂苷合成过程中的功能,根据已知的启动子序列设计引物,以三七基因组DNA为模板成功克隆出PnDS、PnSS、PnSE和PnCAS上游部分启动子序列。利用诱饵质粒pAbAi的多克隆位点将载体分别与四个关键酶基因的启动子序列相连接获得重组诱饵质粒pAbAi-PnDSP、pAbAi-PnSSP、pAbAi-PnSEP和pAbAi-PnCASP;将目的基因PnbHLH与酵母猎物载体pGADT7连接,获得重组猎物载体pGADT7-PnbHLH。将猎物载体pGADT7-PnbHLH分别与四种重组诱饵质粒共同转化酵母细胞Y1HGold,并在选择性培养基SD/-Leu/AbA上培养。结果表明,含有重组质粒pAbAi-PnDSP、pAbAi-PnSSP和pAbAi-PnSEP的酵母细胞能生长,而含有重组质粒pAbAi-PnCASP的酵母细胞不能生长。说明PnbHLH转录因子可与DS、SS和SE基因启动子序列发生特异性结合,由此证明PnbHLH转录因子通过多点调控三七皂苷生物合成途径关键酶基因的表达间接影响三七皂苷的合成,且与CAS基因的RNAi协同作用会进一步的提高三七皂苷的含量。