苯丙烷代谢是植物最重要的次生代谢途径之一,一切含苯丙烷骨架的物质如木质素、黄酮、酚酸类化合物等都是通过这条途径直接或间接合成的。4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是苯丙烷途径中的关键酶,4CL处在总途径向分支途径的转折点,控制着苯丙烷类化合物的代谢方向。4CL一般以基因家族形式存在,包括2-5个成员。4CL的催化机制、表达模式和功能在拟南芥、杨树、大豆等双子叶植物中得到了广泛的研究。双子叶植物的4CL分两类,一类主要调控木质素的合成,另一类主要参与黄酮类化合物的生物合成。单子叶植物具有与双子叶植物不同的木质素单体和细胞壁酚酸类化合物组成。本课题以单子叶的模式植物水稻为材料,研究了水稻不同4CL的酶学性质、表达模式和系统进化。并利用生物信息学方法对来自16个物种的42个4CL基因的系统发生关系和选择压力等进行系统的分析。主要结果如下：1.水稻4CL的底物特异性单底物酶促反应表明,香豆酸是所有水稻4CL同工酶的最适底物,其次是阿魏酸,再次是咖啡酸,对芥子酸没有活性,5种4CL的活性大小依次为：Os4CL5 > Os4CL4>Os4CL1>Os4CL3>Os4CL2。当三种底物（香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）同时存在时,Os4CL1, Os4CL2, Os4CL3, Os4CL4和Os4CL5催化三种产物香豆酰CoA,阿魏酰CoA和咖啡酰CoA形成的比值分别为1：0.72：0.06,1：0：0.09,1：0.43：0.07,1：0.45：0.07和1：0.48：0.02。香豆酰CoA是多底物酶促反应的主要产物,阿魏酰CoA也是多底物反应的一个重要产物,香豆酸和阿魏酸的存在抑制4CL对咖啡酸的利用。2.水稻4CL的表达模式4CL基因的表达具有明显的组织特异性。Os4CL3在所有检测的组织中高水平组成型表达,特别是在木质化程度最高的颖壳和茎中,表达量最大。Os4CL1的表达量最低,主要在胚根和颖壳中表达。Os4CL2的表达模式与其它4CL明显不同,Os4CL2在花药中的表达量最高,其在花药中的mRNA积累量,分别是其在颖壳和茎中积累量的10倍和30倍,是其它4CL基因在花药中表达量的20倍左右。Os4CL3、Os4CL4和Os4CL5能被机械损伤诱导表达,其mRNA积累量分别在损伤后的4 h、1 h和6h达到最大,分别是对照的6倍、3倍和7倍。紫外辐射能强烈诱导Os4CL2的表达,Os4CL2在诱导后12h的mRNA积累量是对照的16倍,并且在24 h内一直保持高水平表达。3.水稻4CL的功能根据4CL的底物催化性质,表达模式和系统发生分析的结果,推测水稻Os4CL2的主要功能是调控黄酮类化合物的生成,而Os4CL1、Os4CL3、Os4CL4和Os4CL5的主要功能是参与木质素的生物合成。4CL介导的香豆酸转化反应是水稻木质素合成的主要途径,这与双子叶植物的木质素合成途径相同。4CL介导的阿魏酸转化反应也是水稻木质素合成的重要途径。4.被子植物4CL的系统发生分析单、双子叶的4CL各自形成独立的进化支,说明4CL基因的功能分化发生在单、双子叶物种分化之前。5.被子植物4CL的进化4CL可能由共同祖先基因重复产生,在进化的过程中,一部分4CL保持原有的黄酮合成功能,另一部分4CL产生新的功能,即木质素合成功能；参与黄酮合成的4CL基因主要受净化选择作用,可能与其抗紫外线和病虫胁迫能力有关,参与木质素合成的4CL基因受到显著的正选择,提示正选择可能是驱动基因发生功能分化的重要动力。在氨基酸水平上,共鉴定出10个正向选择位点（双子叶4个,单子叶6个）,这些位点大多位于酶的底物结合区和催化区,暗示发生在这些位点上的非同义替换在木质素相关基因的进化中起重要作用。以木质纤维素为原料生产燃料乙醇是解决能源危机的有效途径。木质纤维素资源非常丰富，而且可再生。但是，预处理和酶解费用较高严重制约了纤维素乙醇生产的商业化。利用植物生产纤维素酶，以及干扰细胞壁的木质素合成是降低生产成本的可行方法。另外，增加植物的多糖含量也能提高纤维素乙醇的产量。因此，本课题做如下研究：①通过根癌农杆菌介导将里氏木霉的内切葡聚糖酶基因EGH转入水稻，探讨利用植物生产纤维素酶的可行性；②通过RNA干扰抑制水稻木质素合成关键酶基因O4CL4的表达，研究其对木质素代谢的影响；③在水稻中超表达拟南芥的纤维素合酶基因，研究其对细胞壁组成的影响。获得的主要结果如下：1．EGH的密码子优化EGⅡ中有8个密码子在水稻中的使用频率偏低（小于15％），通过定点突变将这8个密码子变为水稻的偏爱密码子。2．EGⅡ超表达载体的构建纤维素酶的表达量偏低是目前纤维素酶在植物中表达面临的主要困境之一。本研究从4个方面优化基因的表达，以提高EGH的表达量：①启动子：水稻Rbes启动子和雌二醇诱导型启动子②5’UTR：使用烟草花叶病毒的Q序列；③亚细胞定位：分别将基因定位到叶绿体和质外体表达；④分别表达酶的全长和催化区。3．Os4CL4干扰载体的构建构建水稻木质素合成酶关键基因O4CL4的RNA干扰载体。4．AtCESA8超表达载体的构建利用拟南芥次生壁特异表达的启动子，使拟南芥的纤维素合酶基因AtCESA8在水稻次生壁表达。5．转基因苗的PCR鉴定实验共获得了19个载体的转基因苗，PCR检测阳性。6．EGⅡ抗原的制备选取EGⅡ的非活性区段，原核表达制备抗原。后续实验由本实验室研究生李英继续完成6.E加抗原的制备选取EGII的非活性区段,原核表达制各抗原。后续实验由本实验室研究生李英继续完成。