应激的发生在家畜生产过程中难以避免,长时间应激会导致家畜的生产力下降。应激反应主要是通过下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴调节,产生大量的应激激素即糖皮质激素（glucocorticoid,GC）并对动物机体能量代谢产生较大影响。据报道m~6A修饰在应激反应调节中具有重要作用,也参与了肌肉生长发育的过程。课题组前期研究表明,用皮质醇饲喂仔猪后,其增重率极显著下降,并且用糖皮质激素类似物地塞米松（Dexamethasone,DEX）处理猪骨骼肌细胞会导致细胞蛋白质的合成减少和分解增加,而蛋白质的合成与氨基酸转运体转运氨基酸的量是有关的。在这些研究的基础上,本研究继续探究在应激状态下猪骨骼肌细胞发生m~6A修饰水平的变化和影响其蛋白质合成的主要氨基酸转运体及其调控的分子机制。主要研究结果如下:1.地塞米松对猪骨骼肌细胞蛋白质合成的影响使用DEX处理猪骨骼肌细胞48h后再使用SUn SET非放射性技术检测蛋白质的合成速率,结果显示DEX处理细胞会降低细胞蛋白质合成速率,添加其拮抗剂RU486后,结果显示蛋白质的合成速率发生上调。m TOR信号通路的传导在蛋白质合成的过程中具有重要作用,使用DEX处理细胞后检测m TOR信号通路及其下游两个效应因子S6K1和4EBP1的磷酸化水平,结果显示DEX处理细胞后,m TOR、S6K1和4EBP1的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。2.地塞米松对猪骨骼肌细胞内m~6A甲基化修饰的影响用地塞米松处理猪骨骼肌细胞后,利用斑点杂交和高效液相色谱-质谱联用发现细胞内总体m~6A修饰水平降低。当在细胞中加入等浓度的RU486后,m~6A修饰水平又恢复了正常水平,说明应激调控了猪骨骼肌细胞中的m~6A水平。细胞中m~6A修饰水平一般与甲基化修饰酶的表达量有关,同时在DEX处理猪骨骼肌细胞后,结果显示m~6A甲基化酶METTL3、METTL14的表达量显著降低（P<0.05）,同时m~6A阅读蛋白YTHDF2的表达量显著上调（P<0.05）。3.地塞米松对差异氨基酸转运体基因的影响在课题组前期利用皮质醇饲喂仔猪后得到的肌肉样品中,使用q PCR检测氨基酸转运蛋白SLC7A7的表达量,结果显示,在皮质醇饲喂仔猪的样品中SLC7A7的表达量极显著下调（P<0.01）。在猪骨骼肌细胞中使用DEX处理后检测SLC7A7基因的表达变化,发现SLC7A7的表达量极显著下调（P<0.01）。使用Me RIP-QPCR检测DEX处理后SLC7A7基因上的m~6A修饰水平的变化,结果显示,用DEX处理后SLC7A7基因m RNA m~6A修饰的显著下调（P<0.05）,同时当我们使用m~6A甲基化修饰抑制剂DAA处理细胞后,发现SLC7A7的表达量极显著下调,说明DEX以依赖m~6A修饰地方式介导SL7A7基因的表达。4.SLC7A7对蛋白合成的影响通过对猪骨骼肌细胞进行SLC7A7的超表达后,结果表明,超表达SLC7A7后,蛋白质的合成速率上调,促进骨骼肌蛋白质分解的Atrogin-1和MSTN基因的m RNA表达水平显著下调（P<0.05）。同时m TOR信号通路的传导增强,结果显示m TOR和S6K1的磷酸化水平极显著上调（P<0.01）;当干涉SLC7A7后,发现蛋白质的合成速率下降,促使蛋白质合成的IGF1基因的表达水平显著下调（P<0.05）,同时m TOR、S6K1和4EBP1的磷酸化水平显著下调（P<0.05）。说明氨基酸转运体SLC7A7通过调控m TOR信号通路的传导控制蛋白质的合成。结论:动物机体发生应激时,机体内的糖皮质激素水平升高,细胞内的m~6A甲基化修饰水平显著下调,介导氨基酸转运体SLC7A7基因m RNA m~6A修饰水平显著下调,从而导致SLC7A7的表达量显著下调,m TOR信号通路传导减弱,这一现象造成猪骨骼肌细胞的蛋白质合成减少。