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斑节对虾（Penaeus monodon）是我国的固有品种,是当前世界上三大养殖虾类之一。然而,近年来由各种原因导致的病害频繁爆发,阻碍了对虾养殖行业的健康发展。在这些病害中,白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）引发的病毒性疾病和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的细菌性疾病是对虾养殖中影响最为严重的两种病害。三基序家族（Tripartite motif family,TRIM）蛋白在参与调控制先天免疫信号通路和抵御病原菌入侵中起着不可替代的作用。因此,了解TRIM家族蛋白成员在对虾先天免疫反应中的作用,对参与WSSV病毒和副溶血弧菌感染的TRIM蛋白进行鉴定和功能分析,对预防和控制对虾病害有重要的意义。本文从斑节对虾的转录组文库中筛选和挖掘出了 TRIM家族的两个成员PmTRIM9和PmTRIM50-like,并对其进行了基因克隆和原核表达分析。通过分析他们在感染副溶血弧菌和WSSV过程中的免疫功能,来阐明其调节对虾先天免疫信号通路的分子机制。1.TRIM50-like可能通过其介导的细胞自噬和泛素化作用来参与抑制WSSV病毒的复制哺乳动物中,很多TRIM蛋白作为细胞自噬的核心组分,在调节细胞自噬方面起至关重要的作用。另外,很多TRIM蛋白还可以通过多种方式来实现抗病毒功能。然而,在甲壳动物中还没有关于TRIM蛋白参与细胞自噬和病毒感染的研究报道。在本研究中,我们从斑节对虾克隆并鉴定了一种TRIM50-like基因,并将其命名为Pm TRIM50-like。PmTRIM50-like的ORF全长为1245 bp,编码一个长度为414aa的蛋白质。PmTRIM50-like含有一个典型的RING结构域,一个B-Box结构域和一个Cyclophilin结构域。系统进化树结果表明,PmTRIM50-like与伊比利亚鼹鼠的E3泛素蛋内连接酶TRIM50进化关系最近。通过qRT-PCR和Western blotting检测发现,PmTRIM50-like广泛分布在肠、胃、血细胞、鳃、心脏、大脑、肝胰腺和肌肉中,其中PmTRIM50-like在肠道和胃组织中的相对表达量较高。在受到WSSV感染后,PmTRIM50-like蛋白及其mRNA在肠道和血细胞中显著上调表达。与感染前相比,PmTRIM50-like在肠道和血细胞中的表达量分别上升了 16.6倍和10.6倍。这说明PmTRIM50-like可能参与WSSV感染过程。RNA干扰实验结果表明,当Pm TRIM50-like的表达被干扰后,对虾体内的VP28在转录和翻译水平的表达量明显增加,WSSV病毒的拷贝数显著增加,对虾的存活率显著下降。过表达实验结果表明,当过表达对虾体内的PmTRIM50-like tnRNA后,对虾体内的VP28在转录和翻译水平的表达量明显减少,WSSV病毒的拷贝数也显著降低。这说明Pm TRIM50-like在斑节对虾体内参与抑制WSSV的复制。Western blotting、透射电镜和免疫细胞荧光化学实验结果表明WSSV或细胞自噬诱导剂雷帕霉素刺激能诱导对虾细胞自噬的发生。而细胞自噬在对虾内被证明起抑制WSSV复制的作用。当干扰PmTRIM50-like的表达后,结果显示WSSV或剂雷帕霉素诱导的细胞自噬作用被明显抑制。这说明斑节对虾PmTRIM50-like参与正向调节细胞自噬的发生。进一步实验结果表明,干扰Pm TRIM5 0-like的表达后,雷帕霉素诱导的对虾细胞自噬被抑制,从而失去抑制WSSV复制的作用。这说明pmTRIM50-like可能通过正向调节细胞白噬来参与抑制WSSV病毒的复制。Pull-down和体外泛素化实验结果表明,PmTRIM50-like可以识别并泛素化WSSV的囊膜蛋白VP24、VP26和VP28。综合以上结果,本研究表明PmTRIM50-like可能通过自身介导的细胞自噬和泛素化来参与抑制WSSV的复制。本文首次报道了对虾TRIM家族蛋白在病毒感染和细胞自噬中的作用。2.TRIM9通过参与负调控斑节对虾Relish信号通路来促进副溶血弧菌感染TRIM9在调节先天免疫信号通路中发挥重要作用。本研究中,我们从斑节对虾中克隆了一个TRIM9基因类似物,将其命名为PmTRIM9。PmTRIM9具有一个长度为2064 bp的开放阅读框,编码一个长度为687个氨基酸的蛋白质。PmTRIM9含有一个RING结构域,2个B-Box结构域、一个Coiled-coil结构域、一个fibronectin type Ⅲ repeat（FNⅢ）结构域和一个SPRY结构域。系统进化树结果表明,PmTRIM9和凡纳滨对虾的TRIM9进化关系最近,与其聚为一支。通过qRT-PCR检测发现,PmTRIM9在肠道和脑组织中的相对表达量较高。副溶血弧菌感染对虾后,PmTRIM9的mRNA在肠道和血细胞中表达水平显著降低。这说明PmTRIM9可能与副溶血弧菌感染相关。为了探究PmTRIM9的功能,我们向对虾注射PmTRIM9的干扰RNA和重组蛋白。结果表明干扰PmTRIM9的表达能抑制副溶血弧菌在斑节对虾中的繁殖,提高对虾感染副溶血弧菌后的成活率。注射PmTRIM9的重组蛋白后能促进副溶血弧菌在斑节对虾中的繁殖,降低对虾感染副溶血弧菌后的成活率。这说明PmTRIM9在斑节对虾中能促进副溶血弧菌的感染。双荧光素酶报告检测结果表明PmTRIM9在HEK293T细胞中具有抑制NF-κB启动子活性的能力。体内实验结果表明敲低PmTRIM9表达可以增加对虾核转录因子PmRelish的表达。通过实验结果我们发现斑节对虾PmRelish参与感染副溶血弧菌的过程,并在对虾体内发挥抑制副溶血弧菌感染的作用。进一步的RNA干扰实验表明,干扰PmRelish会促进副溶血弧菌感染,并降低包括PmCRU5,PmCRU7,PmALF6,PmALF3,PmLYZ和PmPE5在内的特定的抗菌肽（AMPs）的表达。然而,PmCRU5除外,干扰PmTRIM9却增加了PmCRU7,PmALF6,PmALF3,PmLYZ和PmPEN5抗菌肽的表达,这表明PmTRIM9可能负调控PmRelish介导的抗菌肽的表达。综上所述,PmTRIM9可能通过参与抑制斑节对虾的Relish信号通路来促进副溶血弧菌的感染。