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紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优质的豆科牧草,在我国已有两千多年的栽培历史,由于其具有适口性强、营养丰富、产草量高等优点,素有“牧草之王”的美誉。苜蓿在畜牧业中占有很重要的地位,利用基因工程技术来提高苜蓿的抗逆性及改良其品质,期望获得优良新品系,这对我国畜牧业的发展有着极其重要的现实意义。老芒麦(Elymus sibiricus)和垂穗披碱草(E. nutans)都是禾本科披碱草属多年生草本植物,具有对土壤要求低、抗寒、抗旱和耐盐碱等特性,是具有较高经济价值的栽培牧草。利用基因工程技术来培育能够满足不同生产需求的优质牧草,对推动我国畜牧业的发展具有重要意义。然而目前关于老芒麦和垂穗披碱草组织培养的有关报道较少,其组培再生体系的建立还处于探索阶段。本研究借鉴了多年生黑麦草(Lolium perenne)、高羊茅(Festuca arundinacea)和羊草(Leymus chinensis)等重要牧草组织培养的有关文献资料,以老芒麦和垂穗披碱草幼穗为外植体初步建立了两种牧草的组织培养再生体系。1.紫花苜蓿再生体系的建立及GUS基因转化的研究本研究以紫花苜蓿“中苜1号”作为转化受体,在以子叶为外植体转化苜蓿的过程中,建立了紫花苜蓿组织培养再生体系,为苜蓿转基因研究工作打下了良好的基础。在此基础上,将报告基因GUS通过农杆菌的介导,转化到“中苜1号”中,得到了疑似Kan抗性植株。主要研究内容如下：1)再生体系的研究。分别以子叶和下胚轴作为外植体,通过实验比较发现,两种外植体的愈伤诱导率都比较高,但是子叶的分化能力较好,更适合作为转化受体；选择UM+2.0mg/L2,4-D+0.25mg/L KT为最佳愈伤诱导培养基；UM+2.0mg/L KT作为最佳愈伤分化培养基；1/2MSo作为最佳生根培养基。2)根癌农杆菌介导的GUS基因转化“中苜1号”遗传转化体系的建立。将苜蓿6日龄幼苗子叶外植体预培养3d,将其浸入OD600值为0.5的农杆菌中振荡侵染10min,共培养3d,之后转入含有500mg/L Cef抗生素的培养基上进行除菌培养(每继代一次将Cef浓度降低100mg/L),待胚性愈伤形成后将其转入含有50mg/L Kan培养基上进行筛选培养,最后在1/2MSo培养基上生根成苗。3)转化再生苜蓿的获得及PCR鉴定。经筛选,得到26株疑似Kan抗性植株,经PCR检测,全部表现为假阳性。2.老芒麦、垂穗披碱草组织培养再生体系的研究在本研究中,以老芒麦和垂穗披碱草的2-3mm幼穗切段为外植体,初步筛选出最佳的老芒麦幼穗的愈伤诱导培养基为MS+2.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,最适于垂穗披碱草幼穗的愈伤诱导培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；最佳诱导二者愈伤分化的培养基为MS+1.0mg/L KT+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；对于植株非常有效的生根培养基为1/2MS。最终得到老芒麦再生植株10株和垂穗披碱草再生植株2株。