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小儿腹泻是一种由轮状病毒导致的病毒性疾病,新生婴儿的致死率达80%,全球性危害较严重。VP6蛋白是轮状病毒的免疫原性的结构蛋白,如能在动物的乳腺中表达VP6蛋白,将有可能生产出抗轮状病毒的口服疫苗。为此,本研究拟应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,将具有免疫原性的轮状病毒结构蛋白VP6基因敲入到兔酪蛋白基因座的下游,以期利用酪蛋白的内源性基因调控系统指导外源基因VP6蛋白的表达,在兔奶中获得轮状病毒VP6重组蛋白,为应用乳腺生物反应器生产抗腹泻的口服疫苗奠定基础。研究获得如下结果:1、CRISPR/Cas9介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测参考兔酪蛋白基因组序列,设计靶向兔酪蛋白位点第6外显子区的g RNA,构建4条g RNA载体对应的RGS载体,然后转染人293T细胞验证4条g RNA的切割活性。g RNA载体转染293T细胞48小时后的绿色荧光和红色荧光检测结果及流式细胞检测结果显示,4条g RNA均具有切割活性。电转Cas9表达载体及4条g RNA质粒到兔成纤维细胞,靶位点特异性PCR扩增及扩增片段的T7E1酶切结果显示,4条g RNA在内源性靶位点均具有切割活性,4条g RNA的效率分别为:g1:37.1%,g2:42.0%,g3:60.7%,g4:62.4%。显微注射Cas9m RNA及4条sg RNA到兔受精卵胞质,验证胚胎水平4条g RNA的编辑效率,结果发现,四组胚胎发育率无显著差异(g1:72.77±1.12%,g2:70.33±0.56%,g3:73.33±1.84%,g4:73.44±0.86%vs对照组:73.25±1.03%,P>0.05),g RNA4的编辑效率(T7E1酶切分析结果)显著高于其余3条(g4:72.76±0.32%vs g1:30.14±1.93%,g2:38.53±0.75%,g3:52.26±1.16%,P<0.05),表明g4位点的外源基因整合效率较高。2、不同长度同源臂对外源基因定点敲入酪蛋白位点效率的影响为验证不同长度同源臂的打靶载体在体内同源重组效率,在设计200bp长度同源臂及1000 bp长度同源臂的打靶载体,通过扩增靶向兔酪蛋白g4位点两端的序列,分别获得200 bp与1000 bp的同源臂序列,然后以p EGFP-N1为模板,扩增EGFP片段,经一步法将两端同源臂与EGFP基因克隆到双酶切的p MD18-T载体上,构建得到两组不同长度同源臂的打靶载体,再通过共转Cas9载体、g RNA4载体及两组同源打靶载体到兔成纤维细胞,验证两组载体的基因打靶效率。结果发现:两组长度打靶载体均能在内源性基因位点介导外源基因的定点整合。为验证两组打靶载体在胚胎水平的敲入效率,两组打靶载体分别与体外转录的Cas9m RNA和sg RNA4胞质注射到兔受精卵内,培养5天后收集单个囊胚进行5’J和3’J特异性检测。结果显示:1000 bp同源臂的打靶载体效率与200 bp同源臂的打靶载体差异不显著(17.25±1.60%vs 19.23±1.73%,P>0.05),但200 bp打靶载体介导的阳性敲入胚胎中未能检测到完整的5’J和3’J PCR产物(多为3’J),而1000 bp打靶载体组阳性敲入胚胎中75%的胚胎能够完整的扩增出5’J和3’J PCR产物。表明同源臂为1000 bp的打靶载体打靶效率较高。3、CRISPR/Cas9介导的VP6定点整合兔的生产与鉴定在上述工作的基础上,利用靶向兔酪蛋白的g4位点构建1000 bp同源臂的轮状病毒结构蛋白VP6基因的打靶载体,然后与Cas9和g RNA4共转兔成纤维细胞验证打靶载体的效率。PCR和测序结果显示,VP6基因整合到了酪蛋白基因座g4位点,表明构建的VP6打靶载体在细胞水平是有效的。而后,将Cas9m RNA(100 ng/μL)和Cas9蛋白(100 ng/μL)分别与sg RNA4(50 ng/μL sg RNA4)及VP6打靶载体(100 ng/μL)混合注射到兔受精卵胞质,培养5天后收集囊胚进行外源基因整合检测。结果显示:虽然Cas9m RNA组的整合效率显著高于Cas9蛋白组(20.0%±2.6%vs10.3%±3.1%,P<0.05),但Cas9蛋白组阳性胚胎100%完整的整合,而Cas9m RNA组有37.5%未完整整合。将来自Cas9m RNA组的91枚胚胎移植到12只受体兔,8只怀孕,产仔20只;将来自Cas9蛋白组的82枚胚胎移植到11只受体兔,6只怀孕,产仔15只。Cas9m RNA移植组获得两只VP6整合仔兔,但两只均未能完整扩增5’J和3’J产物(F0-A3:3’J;F0-A12:5’J),而Cas9蛋白组成功获得一只VP6定点完整整合的基因编辑兔。上述结果表明,g RNA4的酪蛋白位点靶向切割效率较高;打靶载体的同源臂长度对基因打靶效率有影响,1000 bp的同源臂优于200 bp的同源臂;Cas9蛋白的同源重组效率优于Cas9m RNA,注射Cas9蛋白、sg RNA4和VP6-Donor质粒到兔受精卵胞质,可以获得兔酪蛋白定点敲入VP6的家兔。