论文部分内容阅读
背景:ALI（Acute lung injury,急性肺损伤）是一种极具破坏性的疾病,可由创伤、输血、微生物感染等多种原因引起,其中,病毒感染,包括此次的SARS-Co V-2（Severe acute respiratory syndrome type 2 coronavirus,严重急性呼吸综合征2型冠状病毒）感染也会引发ALI。在ALI发展过程中,中性粒细胞和巨噬细胞会在肺内积聚,响应并扩大炎症级联反应,导致肺屏障破坏和弥漫性肺泡损伤,累及其他器官。XFBD（Xuanfei Baidu prescription,宣肺败毒方）作为多版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中推荐的“三药三方”之一,在诊治轻-中症患者上表现出独特的优势,但是缺乏基础研究。PLGA（Poly（lactic acid-co-glycolic acid）copolymer,聚乳酸-羟基乙酸共聚物）作为药物递送系统,是一种应用最成功的生物降解聚合物之一,具有最小的全身毒性,并有助于提高难溶性药物的生物利用度。实验室前期自主开发并制备了耻垢分支杆菌源的LrNs（Lipid remodeling nanoparticles,脂质重构纳米颗粒）,发现其具有体外促进M2型巨噬细胞极化的作用。研究表明在ALI的急性渗出期诱导M2型巨噬细胞极化可以减轻小鼠的ALI。因此,LrNs结合PLGA的功能化纳米颗粒有望成为包裹抗炎药物的新型制剂。目的:1.基于XFBD的临床疗效和COVID-19的临床特征,建立LPS（Lipopolysaccharide,脂多糖）诱导的ALI小鼠模型,探究XFBD的抗炎作用和相应分子机制。2.针对机制上XFBD的主要作用靶标,筛选并挖掘有效中药化合物。3.新型细菌脂质仿生纳米颗粒（PLGA@LrNs）以PLGA为载体包裹代表单体,表面包覆LrNs,比较游离药物、PLGA载药纳米颗粒和载药PLGA@LrNs等不同制剂在ALI中的作用。结果:1.XFBD-H有效防治ALI的发生和发展,具体表现在以下方面。从肺部影像学来看,弥漫性浸润影和致密增高影的发展被抑制;减缓ALI小鼠的体重下降;抑制脾指数、肺指数和肺湿干比值的增大,减轻肺水肿,促进免疫功能恢复;减少白细胞浸润,保护肺泡结构不被破坏;下调ALI小鼠肺组织中IL（Interleukin,白细胞介素）-6、TNF（Tumor necrosis factor,肿瘤坏死因子）-α和IL-1β的转录水平,以及血清中TNF-α的蛋白水平;抑制巨噬细胞和中性粒细胞的募集。2.转录组学数据和网络药理学分析揭示,IL17A可能是XFBD作用的核心靶点,PD-1（Programmed death 1 protein,程序性死亡1蛋白质）/IL17A信号通路可能是XFBD的潜在作用机制。实验证明XFBD-H抑制PD-1、IL17A、Ccl2（C-C motif chemokine ligand2,C-C基序趋化因子配体2）、Cxcl10（C-X-C motif chemokine ligand 10,C-X-C基序趋化因子配体10）、Muc5ac（Mucin-5 subtype AC,黏蛋白5AC）、Timp1（Tissue inhibitor of metalloproteinases-1,金属蛋白酶组织抑制剂-1）和MPO（Myeloperoxidase,髓过氧化物酶）的过表达。IL17A单克隆抗体阻断实验阐明XFBD主要通过PD-1/IL17A信号通路治疗LPS诱导的ALI。3.分子对接的结果显示甘草酸、柚皮苷、毛蕊花糖苷和甘草苷等10种化合物可以与IL17A稳定结合,SPR分子互作分析证实甘草酸与IL17A具有高亲和力。4.体外细胞实验揭示,LrNs显著促进M2型巨噬细胞极化,抑制LPS诱导的M1型巨噬细胞极化和TNF-α的分泌。TEM和DLS的结果显示PLGA@LrNs被成功构建,稳定性较强。PLGA@LrNs具有良好的体外生物相容性,并且具有LrNs调节巨噬细胞极化的特性。5.PLGA包裹GA（Glycyrrhizic acid,甘草酸）的包封率为43±2.7%。体内实验结果证明,PLGA-GA治疗能显著改善ALI小鼠的肺泡结构破坏,减少炎症细胞浸润,增加M2型巨噬细胞数量,抑制炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的转录水平,下调PD-1/IL17A信号通路上多个基因的表达,包括IL17A、Pdcd1、Ccl2、Cxcl10和Timp1,其疗效显著优于游离甘草酸。6.在体内,PLGA@LrNs对正常小鼠的器官和组织形态无影响。PLGA@LrNs-GA可以下调ALI小鼠肺组织中IL-6和IL17A的基因表达,显著抑制M1型巨噬细胞极化,但也表现出了加重炎症反应的趋向,包括大幅度增加了BALF中白细胞数量,以及促进了炎症因子IL-1β和TNF-α的基因表达。结论:1.阐明了XFBD的免疫调节机制,其主要通过PD-1/IL17A途径减少中性粒细胞和巨噬细胞的募集,从而减轻LPS诱导的急性肺损伤。2.挖掘了XFBD中与IL17A具有高亲和力的化合物之一,即甘草酸。3.PLGA-GA提高了甘草酸的生物利用度,针对ALI的疗效显著。4.PLGA@LrNs在LPS诱导的ALI模型中显示出抗炎和促炎的双向作用。