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背景:严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome type 2Coronavirus,SARS-Co V-2)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)给全球公共卫生和经济带来巨大挑战。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是COVID-19常见临床症状。ALI的特点是肺部过度炎症反应介导肺泡毛细血管破坏和肺水肿的形成,主要病理特征为巨噬细胞以及中性粒细胞在肺组织中过度累积和激活。在防治COVID-19过程中,基于临床实践筛选出来的“三药三方”发挥了重要作用,宣肺败毒方(Xuanfei Baidu prescription,XFBD)作为其中之一在改善轻型以及普通型患者临床症状具有独特优势,但其基础研究依然缺乏。课题组前期基础研究表明,XFBD明显改善脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI小鼠肺损伤以及肺水肿、减少肺部巨噬细胞以及中性粒细胞浸润,但对中性粒细胞募集所介导的一系列生物学过程尚未得到很好阐明。因此本课题通过建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型,进一步探究XFBD调节中性粒细胞浸润介导的免疫反应,为临床防治COVID-19提供理论支持。目的:1.基于前期基础研究,建立LPS诱导的ALI模型,明确XFBD对于中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)、血小板-中性粒细胞相互作用的影响。2.探究XFBD调节中性粒细胞行为治疗急性肺损伤的潜在作用机制研究。方法:1.Percoll细胞分离液提取小鼠骨髓来源的中性粒细胞,通过Ly-6G标记中性粒细胞并利用流式细胞术(Flow Cyto Metry,FCM)鉴定其纯度。建立佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)诱导的原代中性粒细胞释放NETs模型,通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色、以及FCM探究XFBD对PMA诱导的NETs形成过程中相关生物标记物:髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、组蛋白H3(Histone H3,H3cit)的影响。2.使用LPS单次气管滴注建立小鼠ALI模型,给予阳性药地塞米松(Dexamethasone,Dex)及不同剂量XFBD治疗48 h,使用微计算机断层扫描技术(Micro-CT,μCT)评估ALI小鼠肺部损伤以及肺水肿。利用酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的表达。通过FCM、IF等实验方法探究XFBD对ALI引起的中性粒细胞募集、NETs形成以及血小板-中性粒相互作用的影响。3.网络药理学进一步揭示XFBD对LPS诱导的肺损伤引起的中性粒细胞募集发挥药效作用的潜在作用机制,通过免疫组化学(Immunohistochemical,IHC)染色法、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、免疫印迹法(Western Blotting,WB)等实验方法对潜在作用靶点进行验证以确保生信结果的准确性和可靠性。结果:1.利用Percoll细胞分离液成功从小鼠骨髓中分离得到中性粒细胞,通过FCM分析Ly-6G+,结果显示中性粒细胞纯度在70%以上;IF结果表明:XFBD 50、100、200μg/m L干预6 h对500 n M PMA诱导的小鼠骨髓来源中性粒细胞NETs形成过程中相关标记物MPO、H3cit有显著的抑制作用,且200μg/m L效果最好。2.与LPS模型组相比,XFBD给药两天能够显著改善ALI小鼠肺部损伤以及肺水肿,降低支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎症因子IL-6、TNF-α的表达。XFBD也可以减少BALF以及肺组织中中性粒细胞的募集,降低与中性粒细胞趋化因子CXCL3(C-X-C motif chemokine ligand 3,CXCL3)和CSF2(Cytokine granulocyte colony-stimulating factor 2,CSF2)的m RNA的表达。肺组织中IF结果显示XFBD可以降低NETs形成标记物MPO、H3cit的表达。小鼠外周血CD41+、Ly-6G+的FCM结果显示XFBD可以减少外周血血小板-中性粒细胞聚集物(Platelet-neutrophil aggregates,PNAs)数量,降低其相互作用分子P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)的m RNA表达。3.网络药理学分析显示CXCL2、CXCR2可能是XFBD作用的核心靶点,CXCL2/CXCR2轴可能是XFBD调节中性粒细胞行为的潜在作用机制;IHC、IF、RT-PCR和WB等实验进一步验证XFBD显著抑制CXCL2、CXCR2的m RNA以及蛋白表达。结论:1.阐明了XFBD对于ALI引起的中性粒细胞过度募集所介导的一系列免疫应答即XFBD抑制中性粒细胞募集、减少NETs的形成、影响血小板-中性粒细胞相互作用。2.CXCL2/CXCR2轴可能是XFBD调节中性粒细胞行为治疗急性肺损伤的潜在作用机制。