论文部分内容阅读
油茶(Camellia oleifera Abel.)虽然被归为耐旱树种,但其主要栽培于南方丘陵山地,极端缺水的干旱环境成为限制油茶生产的主要障碍。本研究以华南地区种植面积较广的岑软2号、岑软3号、桂无1号和桂无4号共4个油茶优良品种为研究材料,对其形态指标和生理指标进行抗旱性进行综合评价。随后根据研究结果选取岑软3号(抗旱品种)和桂无4号(相对不抗旱品种)通过新一代Illumina Hi Seq 2500测序技术对其正常生长和持续干旱胁迫的叶片组织进行转录组测序,从转录组水平探讨油茶干旱胁迫下分子响应及抗旱分子机理。研究结果如下:(1)采用隶属函数方法,在10%,20%,30%PEG干旱胁迫条件下,对油茶4个品种幼苗进行干旱处理0 h,12 h,24 h,36 h和复水12 h的形态指标、生理生化指标、光合生理指标和荧光生理指标共20个指标进行综合评价,结果显示岑软2号和岑软3号抗旱能力较强;桂无1号和桂无4号抗旱能力相对较弱。本研究对4个油茶品种的抗旱性进行综合评价排序,抗旱性由强至弱依次为:岑软3号>岑软2号>桂无1号>桂无4号。(2)利用Illumina Hi Seq 2500高通量测序技术,获得岑软3号0 h,12 h,24 h,36 h和桂无4号0 h,12 h,24 h,36 h共8个转录本数据。共获得76,585个Unigenes,其中52,531个Unigenes成功比对到同源序列;46,171个Unigenes注释到338条KEGG通路;有46,440条编码序列(CDSs)成功比对到相应蛋白数据库并转化为多肽序列。根据q RT-PCR结果显示,所有20个Unigenes的表达量均与RNA-seq结果具有良好的一致性,表明RNA-seq结果具有较高的可信度。(3)本研究获得大量差异表达基因(DEGs),这些基因包含油茶响应干旱胁迫的关键功能基因。其中,有8,836个DGEs富集在39个代谢途径,从中选出map00500淀粉和蔗糖代谢、map00941类黄酮生物合成,map00750维生素B6代谢等与植物抗旱性密切相关的通路进行功能基因的挖掘。有1,209个Unigenes被鉴定出参与了转录调控,属于63个转录因子家族,如:C2H2、b HLH、WRKY、AP2/ERF、b ZIP等与增强植物抗旱性密切相关的转录因子家族;通过对2,299个蛋白激酶相关的contigs进行注释,并将数量较多的23类差异表达的蛋白激酶进行分析,发现了一系列提高植物抗旱能力密切相关的蛋白激酶。(4)研究了油茶POD、CAT和SOD这3类抗氧化酶活性相关基因表达量及表达模式,并揭示影响POD活性相关基因对提高油茶抗旱能力可能起主要作用;对LOX相关基因表达水平进行分析,显示干旱胁迫对桂无4号造成伤害,并诱导LOX相关基因在胁迫处理24 h大量表达。通过筛选出ABA信号转导中PP2C,Sn RK2和NCED相关功能基因,说明其在油茶ABA信号转导中起调控关系;通过筛选出PYCR2和P5CS两类脯氨酸合成的功能基因,BADH甜菜碱合成的相关基因,以及SUS与糖代谢密切相关的基因,说明这些基因对油茶渗透调节起着重要作用;筛选出油茶类倍半萜烯和三萜的生物合成通路基因28个,主要包括:混合香树脂合酶和角鲨烯环氧酶等基因。本研究还注释到60个油茶类黄酮合成相关功能基因;维生素B6代谢途径中,岑软3号吡哆醛激酶相关基因的上调表达和吡哆醛磷酸酶相关基因的下调表达,导致了植株内PNP,PLP,PMP的含量升高,说明与增强其抗旱能力有关。(5)验证抗氧化酶相关基因和渗透调节物质相关基因在岑软3号持续干旱胁迫下的表达模式。其中,CL4548Contig1(POD1)和CL216Contig1(POD12),contig_11343(CAT3)和contig_18823(CAT)的PCR表达量随胁迫的持续而升高,与POD活性和CAT活性的变化趋势一致。而SOD活性相关基因contig_91532(Cu Zn SOD)和contig_73481(Mn SOD)的表达量随胁迫持续而降低。脯氨酸合成相关基因contig_29559(PYCR2)和CL10313Contig1(P5CR),可溶性糖合成相关基因CL65Contig1(SUS2)和contig_2255(SUS2),甜菜碱合成相关基因CL4202Contig1(BADH)均随干旱胁迫的持续而表达量升高,这些功能基因对于增强油茶的抗旱能力具有重要作用。本研究综合评价了华南地区4个主栽油茶品种的抗旱性差异,首次采用高通量测序技术在转录组水平研究油茶的干旱胁迫,获得了大量与提高其抗旱性密切相关的功能基因,为后续进一步开展科学育种提供了大量基因资源。