研究背景与目的肿瘤干细胞(cancer stem cells)是存在于肿瘤中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体,它具有自我更新的能力,是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。到目前为止,人们已成功的从造血系统恶性肿瘤、乳腺癌和脑肿瘤患者组织中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。这证明在肿瘤细胞群体中确实存在一类极少数的能使群体扩增的肿瘤干细胞。肿瘤细胞具有异质化的特性,即由一个克隆来源的肿瘤细胞在生长过程中,形成在侵袭能力、生长速度、分化程度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面有所不同的亚克隆。肿瘤细胞异质性的现象只有用肿瘤干细胞的理论才能解释,即肿瘤干细胞在不同选择压力下,向不同功能方向分化、成熟,造成肿瘤细胞的群体漂移,从而形成异质性。因此,肿瘤干细胞是肿瘤的根源,消灭了肿瘤干细胞就意味着消灭了肿瘤。长期以来,人们发现实体瘤的缺氧程度与肿瘤的不良预后相关。传统的肿瘤化疗主要针对迅速增殖的瘤细胞,TSC在细胞群中增殖缓慢,对化疗不敏感,TSC的膜表面蛋白受HIFs的调控,在低氧环境中能高效地排除药物,保护TSC不被杀灭,其对通过减少肿瘤细胞负载的治疗方法有抗性,而TSC在缺氧的环境中也能得到更好的保护。缺氧的细胞对放疗也不敏感,低氧是胶质母细胞瘤的普遍特征,研究表明胶质母细胞瘤干细胞放射抗性归结于细胞DNA修复能力的增强,提示在缺氧状态下,癌症干细胞的辐射抗性会显著提高。因此不论是化疗或是放疗,缺氧都是肿瘤治疗的重要靶点。miRNA在肿瘤发生、发展、侵袭、转移中起重要作用,相关领域的研究已取得很多成果,为miRNA在肿瘤诊断和治疗中的应用奠定了基础。但miRNA在肿瘤中表达失调的机制等问题仍需要进一步研究。随着研究的深入,miRNA与肿瘤的关系必将得以阐明,miRNA在肿瘤防治中的应用也必将会有更广阔的前景,成为肿瘤治疗的新策略。本研究应用miRNA芯片从miRNA水平分析U87肿瘤干细胞缺氧后的改变,发现U87肿瘤干细胞缺氧后特异表达的miRNA。通过合成特异miRNA mimic (miRNA寡核苷酸模拟物),转染人脑胶质瘤细胞U87肿瘤干细胞。运用细胞和分子生物学实验对其进行功能研究,为脑胶质瘤提供发病机制提供新的思路,也为脑胶质瘤的分子诊断和miRNA治疗奠定基础。研究方法1.将U87细胞接种于含B27、肝素、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子的无FBS的DMEM/F12培养液中,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待U87细胞增殖形成细胞球3～4d后,吸取上清培养液(含细胞球),重新吹打成单细胞悬液,按1：2或1：3比例传代。原代细胞球形成并达到100～200个细胞后,收集其细胞球,以2%多聚甲醛固定,室温15min；10%驴血清封闭10min,加入鼠抗人CD133一抗,4℃孵育过夜；加入Cy3标记的兔抗小鼠二抗,室温孵育2h,Hoechst33342染核。在显微镜下随机选择20个高倍视野进行阳性CSCs计数。缺氧状态下的细胞培养使用缺氧细胞培养箱,培养条件为37℃、5%CO2、1%O2。应用microRNA芯片芯片系统研究U87肿瘤干细胞具有缺氧相关的miRNAs。2.以缺氧与正常的U87肿瘤干细胞的总RNA为模版,使用两部法荧光定量PCR方法,扩增目的基因,同时设U6rRNA为内参。反应结束后,以U6rRNA为内标,采用2-△△Ct方法来计算每种miRNA在的相对定量值。3取对数生长期U87肿瘤干细胞,计数,无抗生素培养基重悬,按6孔板每孔接种3×105细胞,加培养基至2m1,培养16-24h后转染。合成特异miRNA mimic(miRNA寡核苷酸模拟物),转染人脑胶质瘤细胞U87肿瘤干细胞,RT-PCR检测hsa-let-7i表达量,Western Blot检测转染U87肿瘤干细胞Bcl-2Caspase9蛋白的表达,TUNEL检测转染hsa-let-7mimic U87肿瘤干细胞凋亡,流式细胞仪检测miRNA mimics诱导凋亡。研究结果1.应用microRNA芯片芯片系统研究U87肿瘤干细胞具有缺氧相关的miRNAs。经Hy3荧光标记、纯化,进行芯片杂交,图像采集,数据进行归一化处理后,以两种细胞Hy3荧光标记信号强度的比值≤0.5或≥2为标准判定差异表达miRNA。结果发现,与对照组U87肿瘤干细胞相比,处理组的U87肿瘤干细胞中,上调表达的miRNA有10个,下调表达的miRNA有13个。处理组与对照组U87MG比较,细胞中下调表达的miRNAs为hsa-let-7i、hsa-miR-29c sv40-miR-S1-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-58、hsa-miR-625*、hsa-miR-1914、 hsa-miRPlus-G1246-3p、hsa-miR-4279、hsv2-miR-H7-3p、hsa-miR-3679-3p、 hsa-miR-3675-3p、hsa-miR-1246,上调表达的miRNAs是hsa-miR-143、 hsa-miR-124、hsa-miR-15a、hsa-miR-144、hsa-miR-9*、hsa-miR-33b、 hsa-miR-24-1*、hsv1-miR-H4*、hsa-miR-4297、hsa-miR-3613-3p,其中hsa-let-7i、 hsa-miR-143等多个有文献报道与细胞增殖、肿瘤发生发展等密切相关。2. qRT-PCR方法对芯片结果进行检测使用Agilent2100生物分析仪鉴定从干细胞中提取总RNA的质量,分别测定28S/18S峰值面积都在2：1左右,RNA的质量符合荧光定量分析的要求。选取4种miRNA进行qRT-PCR检测。反应结束后,以U6为内参,采用2-△△Ct方法来计算每种miRNA的在处理前后的相对定量值。hsa-miR-124上调10.82±1.17hsa-miR-143上调4.82±0.20hsa-let-7i下调2.04±0.08hsa-miR-29c下调1.96±0.01与芯片结果基本相同(芯片结果：hsa-miR-124上调11.79441663倍,hsa-miR-143上调4.748774253倍,hsa-let-7i下调2.087019倍,hsa-miR-29c下调2.0929982倍)3. hsa-let-7i mimics对U87肿瘤干细胞的生物学影响QRT-PCR检测显示转染hsa-let-7i mimics的U87肿瘤干细胞的hsa-let-7i的表达水平升高。流式细胞仪检测hsa-let-7i mimic转染U87肿瘤干细胞48小时后能诱导U87肿瘤干细胞的凋亡,各组间差异显著(F=464.229,P=0.000),且各处理组与对照组差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：Bcl-2的蛋白水平降低达,Caspase3, Caspase9蛋白水平增强。Tunel检测显示DNA断裂的凋亡细胞标记有增强的荧光。说明转染hsa-let-7i mimics可以诱导U87肿瘤干细胞的凋亡。结论应用microRNA芯片芯片系统研究U87肿瘤干细胞具有缺氧相关的miRNAs,成功筛选到上调表达的miRNA有10个,下调表达的miRNA有13个。选取4种miRNA进行qRT-PCR检测。qRT-PCR结果与芯片结果基本相同,说明芯片结果可靠。文献挖掘发现hsa-let-7i与肿瘤干细胞联系密切。最后运用细胞和分子生物学实验对hsa-let-7i进行了功能研究,证实hsa-let-7i促进U87肿瘤干细胞凋亡。