毕赤酵母的诸多优点决定了其在研究和生产领域具有非常大的研究潜力和商业价值。然而,毕赤酵母中能够被应用于基因工程操作的标记基因数量有限。Sleeping beauty（SB）转座子突变技术是利用SB转座子随机插入引起基因突变的特性而应用于分离及筛选未知基因的突变手段,可以用于挖掘新的标记基因。本研究利用SB转座子突变系统成功构建了一个涵盖毕赤酵母GS115全基因组的突变体库,成功筛选到一个雷帕霉素敏感基因,并利用该基因开发了一种适用于毕赤酵母的反向筛选技术。本研究使用10 ng/m L的雷帕霉素从毕赤酵母突变体库中分离出一株具有雷帕霉素抗性的突变株mut375。以该突变体的基因组DNA为模板,通过热不对称交错PCR（TAILPCR）获取SB转座子侧翼序列,对SB转座子的插入位点进行定位,确定了mut375的突变基因为PAS＿Chr2-2＿0375（命名为kFPR1）。本研究利用同源重组技术敲除kFPR1基因,发现毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,而且回补该基因功能后的菌株恢复了对雷帕霉素的敏感性,证明了kFPR1基因与雷帕霉素抗性之间的相关性。基于kFPR1基因的特性,本研究建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法。以博来霉素抗性基因（ZeoR）作为选择标记,kFPR1作为反向选择标记,构建了两侧携带正向重复序列的标记单元Zeo R-kFPR1。将标记单元通过同源重组整合至毕赤酵母基因组中,引入遗传标记Zeo R。在雷帕霉素培养基上进行反向筛选,通过标记单元两侧的正向重复序列之间的同源重组成功回收了选择标记,证明了kFPR1作为毕赤酵母反向筛选标记的可行性。本研究使用该方法在毕赤酵母中分别敲入了EGFP表达盒和敲除了LYS1基因,以上操作均没有引入非必要的选择标记。本研究建立了一种适用于毕赤酵母的反向筛选标记kFPR1,实现了无选择标记的基因敲除和敲入,为毕赤酵母的无标记基因操作提供了新工具。