尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界水产业的重点培育淡水养殖鱼,并且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。在我国众多养殖鱼类中,罗非鱼是最适合产业化养殖生产和国际贸易的鱼类之一,养殖前景广阔,但是细菌性疾病严重威胁了罗非鱼的养殖,并造成巨大的经济损失。因为鱼类的获得性免疫系统不够完善,所以当鱼类受到外界大量病原菌的刺激时先天性免疫系统将发挥主要的作用。因此,研究尼罗罗非鱼抵御病原菌侵染的分子机理和了解罗非鱼先天免疫反应的调控机理,为鱼类免疫的基础理论研究提供重要依据,可为以后提高鱼类的抗病能力以及研发高效鱼类疫苗提供了理论依据。Akirin是在果蝇防御系统中发现的一种多功能小分子核蛋白,进化上高度保守,广泛存在于无脊椎和脊椎动物中,在抵抗细菌性感染和肌肉再生中发挥着重要作用,并且参与鱼类的先天性免疫防御体系。但目前,Akirin在鱼类方面的研究还较少。本试验采用荧光定量PCR技术检测实验室人工感染尼罗罗非鱼三种病原菌(嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和表皮葡萄球菌)后Akirin1、Akirin2-1和Akirin2-2三个基因在鱼的不同组织和不同时间的表达变化规律。本试验还从分子水平和个体水平上研究了Akirin蛋白对尼罗罗非鱼6种免疫因子的影响及其对3种病原菌侵染鱼体后病原菌增殖的影响,探究了Akirin蛋白在尼罗罗非鱼先天性免疫中的作用机理,并成功地制备了效价较高的Akirin1、Akirin2-1的多克隆抗体。研究结果如下:1.通过qRT-PCR检测发现尼罗罗非鱼Akirin1、Akirin2-1、Akirin2-2基因在肝、脾、肾中均有表达,此结果表明它们在这些组织中起作用。尼罗罗非鱼在感染嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和表皮葡萄球菌后其肝脏、脾脏和肾脏中的Akirin1、Akirin2-1基因的表达量出现显著上调,并上调表达一段时间后逐渐恢复至正常水平,经嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌感染后鱼的肝脏、脾脏和肾脏中Akirin2-2基因的表达量也呈现先上升后下降至正常水平的现象,表明三个Akirin基因均参与了尼罗罗非鱼抵御病原菌感染的免疫防御过程中,随着感染时间的延长,病原菌被逐渐清除,Akirin表达量逐渐恢复正常。2.通过构建重组质粒,原核表达得到了带有6*His标签的22kD、21kD大小左右的重组蛋白pEASY Blunt-E2-Akirin1和pEASY Blunt-E2-Akirin2-1,两个重组蛋白均在包涵体中大量表达,纯化重组蛋白后免疫大鼠得到了尼罗罗非鱼Akirin1和Akirin2-1多克隆抗体,经过ELISA检验抗血清效价均达到1:10000以上,并进行Wertern blot验证,确定抗体特异性良好。3.通过qRT-PCR检测了分别注射Akirin1蛋白和Akirin2-1蛋白4h后鱼肾脏中6种免疫因子的表达变化情况。结果表明,尼罗罗非鱼注射Akirin1蛋白后IL-1、IL-8、IL-12、TNF和IFN的表达量有显著的上调,注射Akirin2-1蛋白后所检测的免疫因子均显著上调表达。表明Akirin1和Akirin2-1能激活免疫应答过程中细胞因子的表达,从而调节机体免疫机能。4.通过细菌计数发现尼罗罗非鱼注射Akirin1和Akirin2-1蛋白后肝脏、脾脏和肾脏中嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和表皮葡萄球菌的生长数量均显著降低。该结果进一步验证了Akirin1和Akirin2-1在尼罗罗非鱼抵御病原菌嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和表皮葡萄球菌感染过程中发挥着重要的作用。综上所述,尼罗罗非鱼Akirin1、Akirin2-1和Akirin2-2三个基因均在抵御病原菌侵染的先天性免疫中发挥着重要作用;Akirin蛋白能激活多种细胞因子的表达,并能够抑制病原菌在尼罗罗非鱼体内的增殖。成功地制备了效价较高的Akirin1、Akirin2-1的多克隆抗体。本试验研究结果为提高鱼类抗病力及研制高效鱼类疫苗提供了理论基础,并为今后Akirin的实际应用提供了技术支持。