甾体激素类药物是临床上一类重要的药物,常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。其中氢化可的松(Hydrocortisone,HC)主要用于治疗胶原性疾病,如风湿热、风湿性关节炎、红斑狼疮、过敏性疾病及阿狄森氏病,也用于昏迷、休克、严重感染的抢救等。目前国内工业上主要采用蓝色犁头霉(Absidiacoerulea)将底物RS-21醋酸酯(cortexolone-21 acetate,RSA)转化为氢化可的松,但其投料量偏低、羟化特异性较差是限制工业生产效率的主要因素。已有的研究表明蓝色犁头霉甾体11β-羟化酶属于细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)酶系,但编码该羟化酶的基因尚不清楚,因此无法利用基因工程手段对生产菌种进行定向遗传改造。为了克隆和鉴定蓝色犁头霉11-β羟化酶基因,本文开展了以下研究工作:(1)通过诱导实验验证了蓝色犁头霉生产菌种的11-β羟基化活性是受底物RSA诱导的;(2)在底物诱导的条件下提取蓝色犁头霉的总RNA并测序,对测序结果进行分析比对得到15个细胞色素P450基因;(3)利用荧光定量PCR对上述细胞色素P450基因分别在底物诱导和非诱导的条件下进行定量分析,确定了 CYP-7、CYP-8和CYP-15基因在转录水平上的表达受底物高度诱导;(4)构建CYP-7和CYP-8基因的酿酒酵母表达载体并获得了相应基因的酿酒酵母重组菌株;对重组酿酒酵母进行留体转化实验,结果显示CYP-7基因的重组酵母对底物RSA有转化活性,转化产物经TLC、HPLC、NMR分析确定为氢化可的松;(5)确定CYP-7基因为蓝色犁头霉留体11-β羟化酶基因,命名为CYP5311B2,该基因全长1988bp,包括7个内含子和8个外显子,开放阅读框长度为1583bp,预测编码527个氨基酸。