血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)异常增殖是动脉粥样硬化斑块形成、高血压和血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病共同的细胞病理学基础。虽然多种细胞因子和血管活性物质能促进VSMC的增殖,但血管紧张素II(angiotensinII, AngII)在VSMC增殖及高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病的发生发展过程中处于关键地位。已经证明,在心血管系统中,VSMC不仅是AngII的一个重要来源,而且也是AngII调节血管功能的重要靶细胞。因此,研究AngII调节其前体基因表达及促进VSMC增殖的作用机制,对阐明血管增殖性疾病的分子机制具有重要意义。为了阐明AngII调节血管紧张素原基因表达及促进VSMC增殖的分子机制,本研究观察AngII对转录激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)表达活化及其对血管紧张素原基因表达的影响;探讨AP-1与信号转导及转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)在调节血管紧张素原基因表达中的相互关系;确定AngII诱导VSMC增殖的信号转导途径及roscovitine抗VSMC增殖的作用靶点。1 AngII调节其前体基因在VSMC中表达的分子机制AP-1是一种激活细胞增殖相关基因表达的转录因子,在AngII诱导其前体基因表达过程中,伴有AP-1(Fos-Jun二聚体)与血管紧张素原基因启动子结合活性的增强。为进一步探讨AngII促进AP-1与其顺式元件结合的分子机制。本部分实验用放线菌酮(cycloheximide, CHX)作为c-Jun的阻断剂,观察AngII对AP-1与血管紧张素原基因启动子相互作用及对血管紧张素原基因表达的影响。实验结果如下:1.1不同剂量CHX对VSMC活力的影响为了观察CHX对VSMC是否具有的毒性,用不同剂量的CHX处理VSMC后,进行MTT分析。结果显示,在15~45μmol/L浓度范围内,VSMC活力无明显变化。提示在该浓度范围内,CHX对VSMC不产生毒性作用。1.2 AngII促进c-Jun蛋白表达与磷酸化Western blot结果显示,AngII作用于VSMC 0.5 h后,细胞核内的c-Jun水平即显著升高并在此水平上保持至3 h。而且,免疫细胞化学染色证实,AngII诱导表达的c-Jun主要分布在细胞核内。用抗丝氨酸磷酸化抗体对核提取物进行免疫沉淀后检测磷酸化型c-Jun水平时发现,伴随着c-Jun表达增高,磷酸化型c-Jun水平也平行升高。用CHX预处理VSMC 0.5 h后,再用AngII刺激,c-Jun表达虽然不受影响,但其磷酸化水平明显降低。结果提示,AngII对其前体基因的正反馈调节是通过促进AP-1表达及诱导c-Jun磷酸化活化而实现的,CHX是一种AP-1磷酸化的抑制剂。1.3 CHX抑制AngII诱导的血管紧张素原基因表达用RT-PCR检测CHX抑制c-Jun磷酸化对血管紧张素原基因表达的影响。结果显示,用AngII处理VSMC 3 h,可显著提高血管紧张素原基因的表达活性。用CHX预处理VSMC可抑制AngII诱导的血管紧张素原基因表达。由此可见,CHX对c-Jun磷酸化的抑制可下调血管紧张素原基因的表达活性,提示AP-1的磷酸化活化是该基因表达所必需的。1.4 AngII促进AP-1与血管紧张素原基因启动子结合为寻找AngII诱导c-Jun磷酸化与其促进血管紧张素原基因表达之间的关系,用EMSA检测AngII对AP-1与其顺式元件结合活性的影响。结果显示,AngII处理VSMC 0.5 h后,核蛋白与探针的结合活性显著升高,至3 h达高峰。分别加入抗c-Jun和抗STAT5b抗体进行超迁移分析,均可出现抗体-抗原-探针形成的超迁移条带。在CHX预处理的细胞,其核蛋白与探针的结合活性明显下降。为了查明CHX抑制AP-1结合活性的机制,对同样条件下收集的核蛋白进行Western blot分析。结果表明,CHX对AP-1结合活性的抑制效应与AP-1蛋白水平无关,而是CHX抑制AP-1磷酸化的直接结果。上述结果提示,AngII诱导AP-1磷酸化是AngII对血管紧张素原基因正反馈调节的机制之一。2 Roscovitine抑制血管平滑肌细胞增殖与c-Jun表达之间的关系Roscovitine作为一种细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)的特异性抑制剂,具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。但roscovitine对VSMC增殖是否具有抑制作用,以及其对VSMC的抑制效应及作用机制与其他细胞是否相同目前尚不清楚。本部分比较roscovitine对VSMC和不同组织来源的细胞系增殖的影响及其作用机制。2.1 Roscovitine对细胞增殖的影响用细胞计数法检测细胞增殖活力。结果显示,被血清和AngII刺激后,VSMC细胞增殖速率显著加快,分别是对照组(无血清培养组)的2.63和1.68倍。不同浓度的roscovitine(15、30、45μmol/L)预处理VSMC 15 h,均可显著抑制AngII诱导的VSMC增殖。抑制率分别为37.3 %、46.7 %和51.8 %。Roscovitine也可显著抑制血清诱导的VSMC增殖。结果表明,roscovitine可显著抑制体外培养的VSMC增殖。Roscovitine也显著抑制血清诱导的HeLa、COS-7、M17细胞的增殖。Roscovitine在30μmol/L时,对HeLa、COS-7、M17细胞的增殖抑制率分别为61.8 %、60.4 %和54.3 % (p<0.001),明显高于对VSMC的抑制作用。结果提示,不同细胞对roscovitine的敏感性有所不同。2.2 Roscovitine对c-Jun蛋白表达的影响免疫细胞化学染色结果显示,在AngII刺激的VSMC中,c-Jun表达明显增多。Roscovitine预处理VSMC可使c-Jun的表达明显下降。Western blot结果进一步证实,AngII和血清刺激VSMC可显著诱导c-Jun蛋白的表达,roscovitine预处理细胞15 h可显著抑制AngII诱导的c-Jun表达。然而,在HeLa、COS-7和M17细胞中,roscovitine预处理细胞对c-Jun蛋白表达无明显影响。在HeLa、COS-7、M17和VSMC中,roscovitine均不影响STAT5b的表达水平。结果提示,roscovitine抗VSMC增殖的作用与其抑制c-Jun表达有关;roscovitine抑制HeLa、COS-7和M17增殖与抑制c-Jun表达无关。说明roscovitine抗细胞增殖的机理在不同细胞是不同的。2.3 Roscovitine在转录水平上抑制c-jun基因在VSMC中的表达为进一步探讨roscovitine抑制c-Jun表达的作用环节,用roscovitine处理VSMC、HeLa与M17细胞后,用RT-PCR检测c-jun基因的转录活性。结果显示,roscovitine可下调VSMC中c-jun mRNA水平,但不影响HeLa和M17细胞对c-jun mRNA的表达,与Western blot结果一致。结果提示,roscovitine通过抑制c-jun基因转录而导致VSMC中c-Jun蛋白水平下降。3 AngII促进VSMC增殖的信号转导途径及Roscovitine抑制VSMC增殖的作用靶点AngII通过与VSMC上的相应受体相互作用而触发细胞增殖信号转导过程,最终引起细胞增殖相关基因表达及VSMC大量增殖。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是转导细胞增殖信号进入细胞核的一条重要信号转导通路。本部分研究观察roscovitine对MAPK信号通路以及对血管紧张素原基因表达的影响,进一步阐明roscovitine抑制VSMC增殖与细胞增殖信号转导之间的关系。3.1 Roscovitine对ERK1/2和c-Jun磷酸化的影响AngII可诱导ERK1/2快速磷酸化,AngII刺激VSMC 5 min,ERK1/2的磷酸化水平达到高峰,30 min仍维持在较高水平上。给予roscovitine预处理VSMC 15 h后,再用AngII刺激细胞,则磷酸化型ERK1/2几乎检测不到,而各组细胞中ERK1/2的总含量没有变化。结果表明,roscovitine可以完全阻断AngII诱导的ERK1/2磷酸化。为观察roscovitine对AngII诱导c-Jun磷酸化的影响,细胞裂解液用抗丝氨酸磷酸化抗体进行免疫沉淀后,用抗c-Jun抗体检测磷酸化型c-Jun水平。结果显示,roscovitine显著降低c-Jun的磷酸化水平。上述结果表明,在VSMC中,roscovitine不仅抑制AngII诱导的c-Jun表达,而且抑制c-Jun的磷酸化。该抑制作用与其抑制AngII诱导的ERK1/2磷酸化有关。3.2 Roscovitine抑制AP-1介导的血管紧张素原基因表达本实验进一步探讨roscovitine对c-Jun/AP-1下游基因血管紧张素原基因表达的影响。RT-PCR结果显示,AngII刺激可显著上调血管紧张素原基因的表达。给予roscovitine预处理VSMC,可显著下调AngII刺激引起的血管紧张素原基因的表达水平。为进一步证实c-Jun在体内的作用,用c-Jun抗体进行ChIP分析后,用PCR扩增血管紧张素原基因启动子中的AP-1结合序列。实验结果显示,AngII处理细胞可增强c-Jun与血管紧张素原基因启动子的结合活性,给予roscovitine预处理VSMC,可显著抑制c-Jun的结合活性。该结果进一步证实,roscovitine通过抑制c-Jun表达与磷酸化、以及抑制c-Jun与血管紧张素原基因启动子的结合活性,而起到抑制血管紧张素原基因表达的作用。4 AP1与STAT5在调节血管紧张素原基因表达中的相互作用AngII诱导其前体基因表达与AP-1和STAT5磷酸化活化有关,表明AP-1与STAT5均参与血管紧张素原基因的反式激活过程。本部分实验探讨这两种转录因子在血管紧张素原基因转录激活过程中的相互作用。4.1 AngII诱导其前体基因表达与促进c-Jun与STAT5b相互作用有关用抗STAT5b抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀,抗c-Jun抗体进行Western blot分析。结果显示,AngII刺激前后,均可检测到STAT5b与c-Jun共沉淀,但AngII刺激后,STAT5b与c-Jun的相互作用明显增强。交互式免疫共沉淀进一步证实,STAT5b与c-Jun之间存在物理学上的相互作用,AngII能够诱导二者之间的相互缔合。4.2 c-Jun和STAT5b以复合物的形式与血管紧张素原基因调控元件相互作用EMSA结果显示,在AngII诱导下,VSMC核蛋白与血管紧张素原基因启动子区AP-1结合位点的结合活性明显增强,加入抗c-Jun或STAT5b抗体均可使核蛋白-DNA复合物发生超迁移。结果表明,核蛋白-DNA复合物中含有c-Jun和STAT5b。由此推测,STAT5b是以直接或间接方式与结合在AP-1结合位点上的AP-1发生相互作用。ChIP分析结果显示,用抗STAT5b抗体沉淀富集的DNA-核蛋白复合物中的DNA片断为模板,可以扩增出含AP-1结合位点的血管紧张素原基因调控区片断;用抗c-Jun抗体沉淀富集的DNA-核蛋白复合物中的DNA片断为模板,可以扩增出含SATA5结合位点的血管紧张素原基因调控区片断。AngII刺激后,从抗STAT5b抗体沉淀的复合物中扩增出的含AP-1位点的片断明显增多;经AG490处理后,该基因片断的扩增产物显著减少。这些结果提示,在体内,c-Jun和STAT5b除分别与血管紧张素原基因启动子区相应的顺式元件结合外,同时c-Jun与STAT5b之间也存在相互作用。4.3 STAT5b与c-Jun体外结合实验GST pull-down结果显示,无论是核蛋白中的STAT5b还是细胞总蛋白中的STAT5b均不能被GST-c-Jun融合蛋白淘选出来。结果表明,c-Jun与STAT5b在体外无直接相互作用。4.4 AP-1与STAT5协同激活血管紧张素原基因的表达报告基因分析结果显示,c-Jun和STAT5b表达质粒共转染293A细胞时,报告基因的相对活力显著升高,表明AP-1与STAT5在促进血管紧张素原基因表达方面具有正协同作用。在HeLa细胞中,AP-1与STAT5可协同抑制报告基因的表达。提示在不同细胞中,血管紧张素原基因的表达需要不同的转录因子进行组合调控。结论1. AngII通过促进AP-1表达及磷酸化活化正反馈调节其前体基因表达。2. Roscovitine通过特异性抑制c-Jun表达而发挥其对VSMC的抗增殖作用。3. Roscovitine抑制VSMC增殖与抑制ERK1/2信号转导通路有关。4. STAT5和c-Jun对血管紧张素原基因的转录激活具有正协同作用。5. STAT5和AP-1是通过与相应顺式元件结合以及二者之间相互作用实现对血管紧张素原基因表达的组合调控。