Vpu（Viral protein U）是HIV-1特有的一个16kDa的I型膜蛋白，包括一段很短的胞外区，一段穿膜区（TM）和一段细胞膜内较长的胞浆区，主要生理功能包括增强HIV-1病毒的释放和下调病毒受体CD4分子避免超感染，同时其TM区可介导Vpu寡聚并具有选择性阳离子通道活性。Tetherin（BST-2、CD317），是一种可以被干扰素α诱导产生的宿主限制性因子，2008年研究发现Tetherin可以将新生HIV-1病毒颗粒束缚在被感染的宿主细胞表面，阻止病毒释放。Tetherin是一种具有独特拓扑结构的II型整合膜蛋白：包含一段N末端胞浆区，一段单次穿膜区（TM），一段胞外螺旋区，以及C末端糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）锚定区。N末端穿膜区和C末端糖基磷脂酰肌醇锚定区均是Tetherin发挥其抗病毒活性所必需的区段。Tetherin可以通过其胞外区的三个半胱氨酸位点（Cys53，Cys63和Cys91）形成同源二聚体。Tetherin还可以限制多种包膜病毒的释放，不仅针对HIV-1，也可以是其他逆转录病毒以及丝状病毒、沙粒病毒和疱疹病毒。HIV-1Vpu蛋白能够高效拮抗Tetherin的这种抗病毒功能。目前Vpu和Tetherin相互作用的分子机制还有待进一步研究。在某些情况下，Vpu能够下调细胞表面Tetherin的含量，并诱导蛋白酶体和/或溶酶体参与Tetherin的降解，从而干扰其功能来促进病毒从感染细胞释放。然而在另一些情况中，Vpu可以不通过诱导Tetherin下调和降解来拮抗其作用。本研究主要围绕HIV-1Vpu与人类Tetherin的相互作用机制这个问题，设计实验，通过各种方法从不同角度解释该问题：通过分子生物学手段对Vpu蛋白关键氨基酸进行突变，在细胞内研究二者相互作用机制；并且利用真核细胞来表达Tetherin和Vpu蛋白，在体外验证二者相互作用；进一步阐释了二者的拮抗机制；进而设计蛋白截短体抑制剂阻断二者相互作用从而抑制HIV-1病毒复制，为抑制剂研究提供了理论基础，这些实验从一定程度上揭示了Vpu与Tetherin相互作用的分子机制。在细胞水平研究二者相互作用部分，通过对Vpu TM区实施突变分析，证明Vpu蛋白上结合Tetherin的界面位于Vpu TM区核心部位，该部位的一些疏水性氨基酸对两个蛋白作用界面的结构稳定性起决定性作用，对其少数氨基酸（15-17位Ile）进行较短删除或替换可在不影响Vpu亚细胞定位和下调降解CD4分子的同时，导致Vpu与Tetherin之间的相互作用受到严重影响，进而影响与病毒释放相关的生物作用。尤其当对Vpu TM区核心区域关键氨基酸进行相似极性氨基酸替换（Ile-Val）仍可保持Vpu拮抗Tetherin的功能，而相反极性的氨基酸替换（Ile-The）则丧失功能，表明Vpu与Tetherin的结合主要是特异性疏水相互作用，靠疏水氨基酸的排列来维持作用界面的结构而并不依赖于个别发挥特定功能的氨基酸。同时Vpu TM M3IV仍然高效拮抗Tetherin，表明通过在关键位点处以相似极性氨基酸替换可以保持Vpu大部分功能，这提升了其它一些报道中丙氨酸扫描突变法给出假阴性结果的可能性。在蛋白纯化及体外相互作用部分中，通过在293T细胞瞬时转染表达C端融合6×His标签的蛋白，利用镍柱亲和层析法，首次从真核细胞中分离纯化到TetherindelGPI和Vpu全长蛋白，并通过共纯化初步得到了二者的蛋白复合物，为进一步的结构研究提供了基础。进而采用Pull down和ELISA两种方法，证实了TetherindelGPI和Vpu蛋白在体外条件下能够保持一定的生物学活性，具备相互结合能力。其中ELISA方法的灵敏度较高，有较好的量效关系。这意味着建立了一种新的Vpu/Tetherin体外相互作用模型，对于今后进一步研究Tetherin和Vpu的相互作用机制以及结合抑制剂体外筛选等实际应用具有重要意义。在拮抗途径研究部分中，首先研究Tetherin的降解作用，发现蛋白酶体抑制剂MG132处理对于降解仅有较弱阻断作用，Cullin1的功能突变体也仅部分地阻止降解，而泛素突变体尤其是K63R对降解的阻止作用相对明显。这表明降解作用是一种内吞-溶酶体途径为主而蛋白酶体途径为辅的复合途径。进一步通过Vpu增量实验发现细胞表面下调作用是与Vpu拮抗Tetherin更为紧密相关的现象。通过Fluo-4AM试剂检测Ca²⁺荧光发现Vpu对胞浆游离Ca²⁺浓度的提升作用，并发现Ca²⁺调控试剂U73122对野生型HIV-1病毒释放具有干预作用，初步地证明了Ca²⁺与Vpu/Tetherin间的生物效应具有一定关联性，结合文献和理论分析提出了由钙离子介导的Vpu拮抗Tetherin作用途径假说，在未来通过更为精细的实验分析，很可能会揭示一条目前未发现的作用途径，并从新的角度对该未解问题提出解释。在抑制剂研究的理论基础部分，设计构建了含有TM区的Tetherin delGPI突变体，拟在Tetherin阳性细胞中过表达此突变蛋白，利用其TM区与Vpu的结合封闭作用，阻断其拮抗内源性Tetherin功能。首先通过病毒释放实验证实了该突变体在人类Tetherin阳性细胞中对野生型HIV-1病毒释放具有抑制作用，而含非洲绿猴TM区的Tetherin AGMTM delGPI没有这种功能。表明这种截短分子通过其人类Tetherin TM区与病毒的Vpu相互结合产生蛋白作用界面封闭作用，竞争性阻断Vpu靶向内源性Tetherin。而在无Vpu情况下，该分子会引起Vpu缺失型HIV-1病毒释放出现微弱回升，表明它干扰了内源性Tetherin的功能，当将其胞外区二聚化位点C53,C63,C91突变成丙氨酸后这种干扰作用基本消失，暗示该现象可能源于异源二聚，即Tetherin delGPI在通过TM区结合Vpu的同时还通过二聚化位点与内源性Tetherin发生较弱聚合作用。该发现证实了通过基因治疗表达某些Tetherin穿膜区肽段分子或通过小分子抑制剂来阻断HIV-1Vpu对内源性Tetherin的靶向与识别过程，会是未来艾滋病治疗中抑制HIV-1复制的一种新颖而可行的方案。本研究为解释HIV-1免疫学特性以及设计和开发新型的HIV-1抑制剂奠定了基础，为抗AIDS研究提供了新思路。