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草乌甲素是从云南滇西特有药用植物滇西嘟啦中分离出来的乌头属植物生物碱,属于现代植物药,具有抗炎、镇痛及免疫调节作用。草乌甲素口服片剂和注射剂早在上世纪八十年代就已经被国家食品药品监督管理局批准在临床上广泛用于治疗风湿性关节炎、腰腿痛、癌性疼痛以及各种原因导致的慢性疼痛。虽然乌头类生物碱的镇痛作用通常被认为与阻断神经元上电压依赖型钠离子通道有关,但并无因果关系实验证据。草乌甲素较宽的治疗指数表明其镇痛作用可能其毒性作用相分离,并且产生镇痛作用可能不是通过阻断神经元上钠离子通道。此外,先前有研究表明乌头类提取物可以通过影响脊髓上dynorphin A的释放,作用于κ阿片受体而产生镇痛作用。因此,我们推测草乌甲素通过刺激脊髓小胶质细胞释放dynorphin A产生镇痛作用,其镇痛作用可以与阻断神经元钠离子通道导致的毒性作用相分离。本研究的主要目标是评价乌头类生物碱草乌甲素在多种动物模型上的镇痛作用和对吗啡耐受的影响,并进一步探索草乌甲素的镇痛作用机制是否通过刺激脊髓小胶质细胞释放dynorphin A。单次鞘内或者全身注射草乌甲素在神经源性疼痛模型、骨癌痛模型和福尔马林二相疼痛中的镇痛效率达60–100%,其中鞘内注射和皮下注射时的ED50值分别是73–120 ng/只和37–50μg/kg。草乌甲素长期单独使用不会引起自身耐受,与吗啡合用也不产生交叉耐受,并且还可以完全抑制吗啡耐受。小胶质细胞特异性拮抗剂米诺环素可以完全拮抗草乌甲素的镇痛作用,而对其神经毒性作用没有影响。另外,草乌甲素刺激脊髓和原代培养的小胶质细胞释放dynorphin A,而不影响星形胶质细胞和神经元释放dynorphin A。此外,草乌甲素的镇痛作用还可以被dynorphin A抗血清和κ受体拮抗剂完全阻断。尽管我们的结果已经证明草乌甲素是通过刺激小胶质细胞释放dynorphin A产生镇痛作用,而不是作用于神经元上的钠离子通道,但是草乌甲素镇痛信号通路的上游机制并没有被阐明清楚。有文献报道草乌甲素的类似物新乌头碱通过升高细胞内c AMP的含量发挥镇痛作用,另一个类似物乌头碱还可以活化p38MAPK信号转导通路。此外,研究表明PKA下游通路的转录因子CREB可以转录和调控dynorphin A前体基因的表达。我们由此推测草乌甲素引起脊髓小胶质细胞释放dynorphin A可能与活化c AMP/PKA/p38 MAPK/CREB信号转导通路有关。我们选用脊神经结扎引起的神经源性疼痛模型进行动物实验,应用实时定量PCR测定prodynorphin的基因表达量和Western Blot技术检测信号通路中PKA、p38 MAPK、ERK、JNK、CREB和NF-κB的磷酸化水平。草乌甲素的镇痛作用可以被腺苷酸环化酶抑制剂DDA、PKA抑制剂H89、p38 MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580和CREB特异性抑制剂KG-501完全拮抗,但是JNK特异性抑制剂SP600125和ERK特异性抑制剂U0126均不能拮抗草乌甲素的镇痛作用。而且,草乌甲素诱导引起的小胶质细胞中prodynorphin基因表达量的升高可以被SB203580和KG-501所阻断,相比之下,另外两种MAPK通路的抑制剂SP600125和U0126均不能影响prodynorphin的基因表达量。此外,草乌甲素还可以显著升高PKA、p38 MAPK和CREB磷酸化水平,但是对ERK1/2和JNK磷酸化水平没有影响。同时,草乌甲素诱导的p38 MAPK通路磷酸化可以被DDA和H89所阻断,并且SB203580还可以抑制草乌甲素诱导的CREB磷酸化。上述实验结果证实了草乌甲素主要是通过刺激脊髓小胶质细胞释放dynorphin A发挥镇痛作用,而不是作用于钠离子通道,表明草乌甲素的镇痛作用可以与毒性作用相分离。而且我们的结果还证明了草乌甲素引起小胶质细胞中c AMP的含量升高,进一步活化c AMP依赖的PKA,PKA通过p38 MAPK信号通路使核转录因子CREB磷酸化,最终升高prodynorphin基因的表达量,产生镇痛作用。概况起来是草乌甲素通过活化c AMP/PKA/p38 MAPK/CREB这条信号转导通路发挥镇痛作用。我们还比较了乌头碱及其炮制过程中的水解产物苯甲酰乌头原碱和乌头原碱在镇痛作用、dynorphin A的释放和神经毒性中的差异性反应。乌头碱是乌头属植物中含量丰富和生物活性强的一种C19双酯二萜型生物碱,在乌头传统炮制过程中主要是其分子结构中的C8乙酰基团和C14苯甲酰基团发生变化。鞘内注射乌头碱和苯甲酰乌头原碱在机械性疼痛和辐射热痛的ED50分别是35 pmol和3.6 nmol,并且它们的镇痛作用可以被小胶质细胞特异性抑制剂米诺环素、dynorphin A抗血清和κ受体特异性拮抗剂Nor-BNI所拮抗。乌头碱和苯甲酰乌头原碱均可以刺激原代培养的小胶质细胞中dynorphin A的表达,其EC50分别是32 n M和3μM。但是乌头原碱既没有镇痛作用又不能升高dynorphin A的表达。鞘内注射乌头碱、苯甲酰乌头原碱和乌头原碱产生主要以死亡和瘫痪为特征的神经毒性,它们的TD50分别是0.5 nmol、0.2μmol和1.6μmol。我们的结果表明乌头碱上的C8乙酰基团和C14苯甲酰基团是其产生镇痛作用和诱导dynorphin A的表达量升高的必需基团。苯甲酰乌头原碱的治疗指数56:1比乌头碱的治疗指数14:1范围更宽和安全,表明了乌头类生物碱的镇痛作用是可以与毒性作用相分离。我们研究结果支持科学合理的进行乌头炮制,但应该采取谨慎的处理方法减少炮制过程中乌头原碱的含量,避免过度炮制。