引言在临床工作中,肾脏肿瘤与膀胱肿瘤属于比较常见的肿瘤类型。尽管肾脏肿癌与膀胱肿瘤的发病率有逐年提高的趋势,但是经综合治疗后肾脏肿癌与膀胱肿瘤患者的生存率还是能有所提高。临床上新技术及新治疗手段的应用可以使部分泌尿系肿瘤患者得到更好的治疗。目前临床上常规的手术治疗被推荐用于治疗局限性肾癌患者亦或非肌层浸润型膀胱癌患者。同时规范的辅助治疗有利于术后患者的预后。分子靶向药物是目前辅助治疗中的明星药物,而基础的分子生物学研究则是推动分子靶向药物创新发展的强大推力。在这个大数据时代,生物信息技术的革新使挖掘分析海量的基因组测序结果变得更加简单有效。有越来越多的学者会倾向于使用基因组测序分析作为其研究的基础并以此寻求新的研究思路。然而仅通过生物信息学筛选分析并不能准确地明确疾病的机制,仍然需要大量的基础实验进行验证。分子医学的急速发展使人们对肿瘤的生物学特性及在其中起关键作用的信号分子及通路更加了解,个体精准治疗也变得愈发可能。在本研究中,我们通过下载分析部分泌尿系肿瘤数据库的测序结果,利用生物信息学工具发掘并预测了部分泌尿系肿瘤潜在的治疗靶点。同时,我们利用多种细胞生物学技术,研究了癌蛋白CIP2A与肾癌的发生发展的关系和其对肾癌的治疗的影响,并初步探讨了其潜在的作用机制。第一部分:应用生物信息学技术筛选部分泌尿系肿瘤潜在治疗靶点研究背景及目的:肾母细胞瘤（wilms瘤）与膀胱癌皆为泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤,其中肾母细胞瘤是儿童中一种常见的恶性肿瘤。膀胱癌的发病率在美国常见的恶性肿瘤中排第五位。尽管二者的预后不尽相同,但目前药物治疗的效果并不能令所有肿瘤患者满意。开发新的分子靶向药物的重点和难点在于药物作用靶点的选取。如何筛选出更加有效的靶点是目前临床及基础研究中亟待解决的问题。本研究中我们利用生物信息学技术筛选出可能与膀胱肿瘤与肾母细胞瘤发生发展相关的核心蛋白及重要信号通路,并初步评估各核心蛋白作为潜在的治疗靶点的研究价值。研究方法:1.从GEO（Gene Expression Omnibus）基因数据库筛选符合条件的数据集并下载整理。对筛选出的膀胱肿瘤的基因芯片数据和甲基化芯片数据使用GEO在线分析工具GEO 2R,设置筛选条件p<0.05,|t|>2,得到差异基因。R软件中应用limma包筛选正常组织样本和肾母细胞瘤样本之间的差异基因。其中筛选差异基因的条件为:P 值<0.05,|log2foldchange（FC）|>1。2.在膀胱肿瘤中得到的差异表达的甲基化基因及差异表达的基因。对低甲基化、基因表达上调的基因做交集。对超甲基化、基因表达下调的基因做交集。并绘制Venn图,得到四组数据集中共同的差异基因。3.为研究差异基因在细胞的位置,主要的分子功能以及其所参与的生物过程,用在线软件DAVID对得到的各组差异基因进行G0富集分析,其中P<0.05作为筛选条件。4.为研究差异基因主要是在哪些信号通路上富集。使用KOBAS 3.0软件对差异基因进行KEGG通路富集分析,设置P<0.05被作为筛选条件。5.为研究蛋白与蛋白间的作用并筛查出于其中关键的核心蛋白。使用String工具在线工具对己得到的差异基因组进行PPI蛋白网络互相作用分析,其中互相作用分数设为>0.4。利用基因关系对的表格,得到基因关系的网络节点数。计算网络节点数的多少,得到核心基因。6.在TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中下载相关数据,对得到的核心差异基因表达结果进一步验证。研究结果:1.对膀胱肿瘤基因表达微阵列数据分析并得到差异基因。在肾母细胞瘤表达微阵列差异基因分析中得到561个表达上调基因和138个表达下调基因2.膀胱肿瘤数据集GSE3167与GSE65635表达上调的基因中有955个重叠。数据集GSE3167与GSE65635表达下调的基因中有873个重叠。基因甲基化微阵列分析中,数据集GSE37816和GSE33510重叠的超甲基化基因有1131个,数据集GSE37816和GSE33510重叠的低甲基化基因有1767个。整合相关结果可得到71个低甲基化/表达上调的基因和89个超甲基化/表达下调的基因。3.在膀胱肿瘤中G0富集分析结果表明,低甲基化/上调基因参与到的生物学过程有细胞间粘附,细胞生长和血管发育。在分子功能中,低甲基化/高表达基因与KDEL序列的结合和钙粘蛋白的结合相关。超甲基化/下调基因参与到的生物学过程有细胞增殖,细胞粘附和信号转导的正调节。超甲基化/低表达基因发挥的分子功能是支架蛋白结合和转录因子活性。在肾母细胞瘤中,差异表达的上调基因主要参与到的生物学过程有代谢和氧化还原过程。在分子功能中,差异表达的上调基因主要与氧化还原酶活性相关。差异表达的下调基因主要参与到的生物学过程有细胞增殖抑制和对药物的敏感性。在分子功能中,差异表达的下调基因主要与转录激活因子活性和转录因子活性相关。4.在膀胱肿瘤中KEGG通路富集分析结果显示低甲基化/高表达基因在果糖和甘露糖代谢,p53信号通路中显著富集。高甲基化/低表达基因在胰岛素分泌,cAMP信号传导通路中富集。在肾母细胞瘤中差异基因主要富集在PPAR信号通路以及化学致癌信号通路中。5.在膀胱肿瘤中我们依据PPI蛋白网络互相作用分析筛选出10个核心的差异基因（CDH1,DDOST,CASP8,DHX15,PTPRF,GNG4,ADCY9,NPY,ADRA2B,PENK）。在肾母细胞瘤中我们同样筛选出10个核心的差异基因（ALB,TOP2A,ALDH1A1,EHHADH,DECR1,ALDH1A3,ALDH4A1,JUN,EGF,ALDH1L1）。6.由GEO数据库筛选出的核心基因以及它们的表达情况有半数通过了 TCGA数据库的数据验证。这证明了我们所得结果的可靠性与稳定性。研究结论:利用生物信息学的基本技术我们研究并分析了部分泌尿系常见肿瘤（膀胱肿瘤和肾母细胞瘤）。筛选出多个可能作为未来治疗膀胱肿瘤和肾母细胞瘤的靶点（如:CDH1,DDOST,CASP8等）。通过GO富集分析与KEGG信号通路分析,明确了在不同泌尿系肿瘤发生发展中可能起关键作用的生物学过程和信号通路（如:p53信号通路等）。为未来的蛋白组学实验及其他细胞生物学实验提供了方向。第二部分:CIP2A对肾癌的生物学作用及其机制研究背景及目的:肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的一类肾癌。目前通过手术切除肿瘤依然是治疗肾癌主要的方法。肾脏肿瘤对常规的放疗及化疗均不敏感,这影响了肾癌术后辅助治疗的效果。尽管有证据表明目前许多临床使用的药物可以提高肾癌的治疗功效,但治疗效果并不令人满意。在部分发达国家,采用新疗法的进展期肾癌患者的中位生存率仅为26个月。因此临床上迫切需要更多的肾癌治疗方案,而明确肾癌的发生发展的机制则是所有临床研究和基础研究的重点。本研究中,我们检测CIP2A在肾癌细胞系和正常肾脏细胞系中的表达。使用小干扰RNA（siRNA）使肾癌细胞的CIP2A基因沉默,并用含CIP2A序列的过表达慢病毒处理正常肾脏细胞促进CIP2A的表达。通过免疫印迹试验（western-blot,WB）验证CIP2A敲除与和过表达的效果。利用细胞生物学技术检测CIP2A对细胞增殖能力及细胞侵袭迁移能力的影响。明确CIP2A是否影响肾癌细胞对顺铂的耐药性以及二者之间的关联。初步研究探讨CIP2A在肾癌中生物学作用及其潜在的机制。研究方法:1.体外培养购自ATCC的肾癌细胞系（786-O,A498,CAKI-1）与人肾皮质近曲小管上皮细胞系（HK-2）,使用免疫荧光染色和免疫印迹试验明确CIP2A在肾细胞系中的表达情况。2.利用特异的CIP2A siRNA减弱肾癌细胞系的CIP2A表达,使用含CIP2A序列的过表达慢病毒转染HK-2细胞促进该细胞的CIP2A表达。经WB明确CIP2A的表达是否得到稳定的减弱或者增强。3.通过EdU细胞增殖实验与集落形成实验观察改变CIP2A蛋白表达水平后,肾细胞系的增殖是否会受到影响。4.通过Transwell细胞体外侵袭迁移实验观察CIP2A表达水平的变化对肾癌细胞的侵袭迁移能力的影响。5.抑制肾癌细胞CIP2A的表达后,使用流式细胞仪检测细胞的周期变化。HK-2细胞的CIP2A的过表达后,使用同样方法检测细胞周期的变化。当改变细胞的CIP2A表达后,利用WB明确周期蛋白的表达结果是否与流式细胞周期检测结果一致。6.设置不同药物浓度梯度并使用顺铂处理实验组及对照组的肾癌细胞系,行CCK-8细胞活力实验检测CIP2A的改变是否影响肾癌细胞对顺铂的耐药性。7.使用不同浓度顺铂刺激肾癌细胞后,行western-blot检测与顺铂耐药性密切相关的蛋白（CIP2A蛋白、EMT相关的蛋白）表达。8.经WB检测CIP2A蛋白表达改变对P-Akt和EMT标志蛋白表达的影响。9.LY294002是特异性的PI3K-Akt信号通路抑制剂。对各肾癌细胞分别或者共同使用LY294002和特异的CIP2A siRNA。经western-blot检测P-Akt蛋白表达变化。分析CIP2A对P-Akt的调节作用与PI3K-Akt信号通路的关系。研究结果:1.免疫荧光染色与免疫印迹试验证明了 CIP2A在所有肾细胞系中都有所表达,且CIP2A在肾癌细胞系中表达明显高于其在HK-2细胞中的表达。2.经免疫印迹试验证明我们成功使用特异的CIP2A siRNA将肾癌细胞CIP2A低表达,通过慢病毒转染HK-2细胞促进了 HK-2细胞中CIP2A的表达。3.EdU细胞增殖实验与集落形成实验的结果显示CIP2A表达降低可以抑制肾癌细胞的增殖,而CIP2A表达增加可以促进HK-2细胞的增殖。4.Transwell细胞体外侵袭迁移实验的结果表明当CIP2A表达减少时肾癌细胞的侵袭与迁移能力也随之减弱,而CIP2A表达增加会使肾癌侵袭与迁移能力增强。5.流式细胞周期检测结果显示抑制肾癌细胞的CIP2A的表达后,肾癌细胞由合成前期（G1）进入DNA合成期（S期）受阻。而对于HK-2细胞,当调高其CIP2A表达时,会促进其由G1到S期的转化。WB检测结果同样表明CIP2A参与调控了细胞由G1期到S期的转换过程。6.当沉默CIP2A的表达时,所有我们用于研究的肾癌细胞系对顺铂的耐药性减弱。而当促进肾癌细胞的CIP2A的表达后,肾癌细胞对顺铂的耐受程度会增强。7.使用不同浓度的顺铂刺激肾癌细胞,伴随着顺铂浓度的升高,肾癌细胞CIP2A的表达逐渐增强。WB检测结果说明肾癌细胞受到顺铂刺激后会趋向于皮间质转化过程。具体表现为随着顺铂刺激的浓度增高,肾癌细胞的上皮细胞标志物E钙黏素（E-cadherin）表达减少,而间质细胞标志物波形蛋白（Vimentin）表达增多。8.当抑制肾癌细胞的CIP2A的表达后,P-Akt与波形蛋白的表达会下调,E钙黏素表达上调。当促进肾癌细胞CIP2A的表达后,P-Akt与波形蛋白的表达会出现不同程度的上调,E钙黏素表达下调。9.对肾癌细胞单独使用LY294002或特异的CIP2AsiRNA都可以下调P-Akt水平,而二者同时应用会引起肾癌细胞的P-Akt水平更明显的下调。这表明CIP2A调控P-Akt表达并不完全依赖PI3K-Akt信号通路。研究结论:体外的细胞实验证明CIP2A不仅可以促进肾癌细胞的增殖,也可以促进肾癌细胞的侵袭与转移。除此之外,CIP2A与肾癌细胞对顺铂的耐药性相关。CIP2A还参与调控了肾细胞周期的G1期到S期转换。CIP2A或许能成为下一个的肾癌治疗的有效靶点。