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第一部分PRMT4在缺血后血管新生中的表达和定位背景:动脉血管负责为全身输送氧气和营养物质,局部组织缺血时,血管的新生和重建对局部组织血流供应的恢复至关重要。PRMT4作为一种蛋白精氨酸甲基转移酶,许多研究显示其作为转录共激活因子,作用于相关底物调控疾病的发生发展。但是它在缺血后血管新生中的作用目前仍然不清楚,本研究主要探讨PRMT4是否参与缺血后血管新生。方法:首先通过小鼠股动脉结扎手术建立小鼠下肢缺血模型（HLI）,取不同时间点的缺血组织,分别利用蛋白质免疫印迹和免疫组化检测PRMT4的表达变化。接下来用组织免疫荧光染色观察CD31、VE-cadherin、CD45和Myosin与PRMT4共定位情况,并用CD31磁珠分离内皮细胞和非内皮细胞检测PRMT4在不同细胞中的表达情况。最后分离人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,检测PRMT4的表达是否受到VEGF刺激的影响。结果:在下肢缺血模型中,PRMT4蛋白表达水平明显升高,在第7天达到高峰,并与VEGF变化呈正相关。免疫组化显示PRMT4在缺血组织中明显增加,并主要存在于间质细胞中。组织免疫荧光显示PRMT4主要与内皮细胞共定位,骨骼肌细胞和免疫细胞中表达较少。体外给予VEGF刺激HUVECs,显示PRMT4蛋白水平增加,而m RNA水平无明显变化。结论:PRMT4在缺血性疾病中表达增高,主要定位于血管内皮细胞,且VEGF可诱导PRMT4蛋白水平升高,提示PRMT4可能参与了缺血后血管新生。第二部分PRMT4在缺血后血管新生中的作用的研究背景:缺血后血管新生主要由缺血缺氧后VEGF诱导内皮细胞增殖、迁移和成管,形成新的毛细胞血管网络进而改善缺血区域血供。在上一部分中,我们证明了PRMT4参与到缺血后血管新生的过程,但PRMT4在缺血后血管新生中的作用还不清楚。在该部分我们主要研究PRMT4在缺血后血管新生中的作用。方法:体内实验中,我们采用腺病毒局部肌肉注射的方法介导PRMT4在局部组织的过表与敲低,同时建立下肢缺血模型,然后分别研究PRMT4过表达和敲低对HLI后下肢血流恢复、毛细血管密度的影响;体外实验中,我们给予HUVECs感染腺病毒介导PRMT4过表达或者敲低,分别检测PRMT4对内皮细胞增殖（Ed U染色）、迁移（transwell试验）和成管（成管试验）的影响。结果:体内实验中,PRMT4的过表达可以促进缺血下肢的血流灌注恢复、增加毛细血管密度;而敲低则可以抑制缺血下肢的血流灌注恢复、降低毛细血管密度。体外实验中,PRMT4在内皮细胞中的过表达可以显著促进HUVECs的增殖、迁移、成管,而敲低则得到相反的表型。结论:PRMT4通过促进内皮细胞增殖、迁移、成管加速下肢缺血后血流灌注的恢复。第三部分PRMT4促进缺血后血管新生的机制研究背景:PRMT4通常作为转录共激活因子参与基因调控,VEGF-VEGFR2信号通路在血管新生过程中是十分重要的信号通路,受到多个层级的调控,包括配体受体表达水平、蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）去磷酸化、受体内吞速率和信号通路交联。我们的体内体外实验证明了PRMT4在缺血后血管新生中的正性调节作用,那么PRMT4究竟是如何影响血管新生的还不清楚,在该部分我们将探讨PRMT4影响血管新生的具体分子机制。方法:首先在我们HUVECs中过表达或敲低PRMT4,检测VEGF的表达水平;然后我们在过表达PRMT4或者敲低的同时给予VEGF刺激不同时间后,检测VEGF-VEGFR2信号通路的变化;接下来通过干预VEGF的表达来明确敲低VEGF能否逆转PRMT4对内皮细胞增殖、迁移、成管的影响;另外我们筛选了影响VEGF-VEGFR2信号通路的关键蛋白（PTPN1、PTPN2、Ephrin B2、VE-cadherin、NRP1、Notch、NICD）,来探索PRMT4如何影响该信号通路。同时,我们考虑PRMT4是否从转录水平影响VEGF的表达,于是我们通过co-IP寻找其相互作用蛋白,免疫荧光观察二者细胞内定位,再通过荧光素酶报告基因确认该蛋白是否影响PRMT4对VEGF启动子的转录活性,最后通过干预该蛋白的表达后检测在HUVECs的表型变化来确认该蛋白能否逆转PRMT4的促内皮细胞增殖、迁移、成管效应。结果:在HUVECs中过表达,能够上调VEGF的m RNA水平和蛋白水平,并激活VEGF-VEGFR2信号通路;而敲低PRMT4则得到相反的效应。此外,敲低VEGF可以部分逆转PRMT4介导的内皮细胞增殖、迁移、成管表型;另外过表达PRMT4会增强Ephrin B2、抑制NICD的蛋白水平。co-IP证明PRMT4和转录因子YB1结合,二者共定位在内皮细胞中,且敲低YB1会抑制PRMT4对VEGF启动子转录活性的影响。最后细胞实验证明敲低YB1可以部分逆转PRMT4的促内皮细胞增殖、迁移、成管效应。结论:PRMT4在机制上一方面通过YB1转录激活VEGF的表达,另一方面可能通过影响受体内吞速率和Notch信号交联来激活VEGF-VEGFR2信号通路,另外VEGF表达上调又进一步增加PRMT4水平,形成一个正反馈环路,进而产生促血管新生的作用。