【摘 要】
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目的:骨组织工程中生物材料是最基础的一环,通过仿生技术模拟骨修复微环境获得理想的修复材料是医学组织工程追求的目标。纤连蛋白（FN）作为细胞外基质（ECM）的重要组成部分,可通过细胞表面的整联蛋白与细胞通讯,进而调控干细胞的命运,对骨缺损修复及骨骼再生医学意义显著。但天然的纤连蛋白来自于血液,提取工艺不稳定、具有较高的免疫原性,功能复杂,不易厘清机制,规模化医学应用受限。本研究以干细胞成骨分化的通讯
【基金项目】
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广州市重点项目“多功能组织工程支架的仿生制备关键技术及其在组织再生修复中的应用”（2021）; 广州市天河区科技计划项目“化妆品新原料重组人胶原肽及其凝胶剂的研究开发”（201803010044）; “重组人胶原蛋白医用植入原料的研究开发”（2019KTSCX011）
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目的:骨组织工程中生物材料是最基础的一环,通过仿生技术模拟骨修复微环境获得理想的修复材料是医学组织工程追求的目标。纤连蛋白（FN）作为细胞外基质（ECM）的重要组成部分,可通过细胞表面的整联蛋白与细胞通讯,进而调控干细胞的命运,对骨缺损修复及骨骼再生医学意义显著。但天然的纤连蛋白来自于血液,提取工艺不稳定、具有较高的免疫原性,功能复杂,不易厘清机制,规模化医学应用受限。本研究以干细胞成骨分化的通讯工具“整联蛋白α5β1”为突破点,设计并获得一种新型重组人纤连蛋白肽（rh FN）,特异性吸附生长因子及促进干细胞成骨分化,可进一步构建成骨组织工程支架材料。方法:（1）利用Prot Param、Prot Scale、TMHMM、Signa IP 4.1 Server、Net NGlyc、Net Phos 3.1 Server等在线软件在线预测人纤连蛋白肽的亲水/疏水性、蛋白的跨膜结构域、蛋白氨基酸序列信号肽、蛋白的糖基化位点、磷酸化位点等生化性质。通过I-Tasser软件建模该蛋白质结构。采用Z-DOCK法分别与整合素α5β1进行分子对接预测其结合能力。（2）根据大肠杆菌偏好进行密码子优化后全基因合成构建p ET20b-rh FN重组质粒,转化到大肠杆菌表达系统进行重组表达和纯化,通过表达菌株及表达条件的筛选和优化,获得高表达rh FN的工程菌株BL21（DE3）。Ni-NTA Sepharose亲和层析柱和阳离子亲和层析柱纯化。并进行了15L发酵罐放大工艺的研究。（3）以ECV304细胞和h PDLSCs细胞为模型细胞采用CCK8、结晶紫染色、细胞骨架染色、细胞划痕实验、管腔形成实验对比研究rh FN与全长人纤连蛋白对2株细胞增殖、黏附和迁移的影响。（4）SPR测试rh FN与生长因子（GFs）之间的亲和力。同时通过管腔形成实验对比研究单独b FGF、单独rh FN、b FGF与rh FN联用对ECV304细胞管腔形成能力的影响。通过成骨分化实验对比研究单独TGFβ3、单独rh FN、TGFβ3与rh FN联用对h PDLSCs成骨分化能力的影响（观察指标包括:碱性磷酸酶（ALP）染色及ALP活性测定,WB检测）。（5）鉴于已有的研究表明整联蛋白α5已被证明在干细胞成骨分化起到重要作用,而整联蛋白β1在干细胞成骨分化过程中的作用鲜有报道,本研究构建并筛选整联蛋白β1慢病毒干扰质粒,通过干扰整联蛋白β1的表达探讨整联蛋白β1在rh FN和/或TGFβ3诱导促进h PDLSCs成骨分化中的作用。结果:（1）人纤连蛋白肽结构域分析显示,该蛋白无跨膜区,有信号肽存在,于21-290位含有跨膜细胞因子受体,粘附分子、生长因子等结合结构域,同时该蛋白有多个磷酸化位点。纤连蛋白肽的二级结构预测显示,该蛋白含有大量无规则卷曲,该结构是组成蛋白质特异的功能部位和酶活性部位。通过ZDOCK对接软件分析人纤连蛋白肽与整合素α5β1的相互作用预测,结果表明所截取的人纤连蛋白肽与整合素α5β1形成较稳定的复合物。（2）构建了p ET20b-rh FN重组表达载体,并成功获得两株工程菌BL21（DE3）/rh FN和Ply Ss/rh FN。同时对重组蛋白rh FN进行表达条件的优化。结果显示,改变IPTG诱导剂浓度没有筛选性。该菌种的最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间4h。HPLC结果显示rh FN纯度达到96%,LC-MS/MS精确分子量测定rh FN的分子量为30.36 k Da,与理论分子量一致,氨基酸序列覆盖度为89.3%。圆二色光谱研究重组蛋白rh FN的二级结构,结果表明rh FN二级结构中无规则卷曲所占比例最高,与预测值相符。通过15L发酵罐扩大培养,rh FN的最大产量达到570mg/L,菌湿重达到60.0 g/L。（3）rh FN分别与b FGF、TGFβ3具有强结合能力。rh FN（30μg/ml）不影响ECV304细胞的增殖,但促进ECV304细胞的黏附（P<0.001,vs全长FN）和迁移（P<0.05,vs全长FN）,同时,rh FN具有促ECV304细胞管腔形成能力,且当rh FN与b FGF联用时,其作用明显优于单独使用。（4）rh FN在一定浓度范围内促h PDLSCs细胞增殖（P<0.01 vs Control）,同时促进h PDLSCs细胞的黏附（P<0.001,vs全长FN）和迁移（P<0.001 vs全长FN）。此外ALP染色及活性测试结果表明rh FN诱导7天显著提高h PDLSCs的ALP活性（P<0.01）,且rh FN与TGFβ3联用时,h PDLSCs的ALP活性显著高于单独使用,WB结果显示rh FN与TGFβ3诱导后,h PDLSCs的α5β1蛋白表达提高（P95%。rh FN具有募集生长因子的能力,同时以α5β1整合素为介导,显著促进了h PDLSCs细胞的成骨分化能力。重组蛋白rh FN可作为骨组织修复工程的一种仿细胞外基质生物材料。
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