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背景与目的:棕色脂肪细胞（BA）通过―燃烧‖脂肪在维持机体能量内稳态（homeostasis）和抗肥胖方面发挥重要作用,但有关BA定向分化的转录调控机`制尚未完全阐明。Osteopontin（OPN）是一种参与了机体许多生理病理过程的细胞因子。我们前期的研究发现,OPN是能诱导BA定向分化的正性调控因子。本研究通过构建脂肪（细胞）特异性的腺病毒载体（Ad-aP2-opn-shRNA）,分别感染3T3-L1前白色脂肪细胞和脐静脉内皮细胞（HUVEC）,目的一是观察Ad-aP2-opn-shRNA感染的特异性;二是观察OPN表达下调对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟BA的影响,进一步确认OPN在前白色脂肪细胞诱导分化为棕色脂肪细胞的作用。方法:（1）最佳opn-shRNA编码序列的筛选:从GenBank中查找鼠源opn基因序列（NM001204201）作为分析序列,采用Ambion公司的网上设计软件,参考小分子干扰RNA设计原则,选择三个干扰靶位点:（1）GCAGACACTTTCACTC CAA,（2）GTCAGCTGGATGAACCAAG,（3）GGATGTGATCGATAGTCAA;针对每个靶位点分别设计2条互补的寡核苷酸序列即shRNA编码序列,并分别命名为opn-shRNA-513,opn-shRNA-514,opn-shRNA-515,将这三条opn-shRNA表达序列克隆到pU6-MCS-AMP质粒的黏性末端,构建对应的重组干扰质粒并也以各自shRNA编码序列名称分别对质粒命名为opn-shRNA-513,opn-shRNA-514,opn-shRNA-515,同时构建阴性对照质粒（negative control,NC）,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定。采用Western blots免疫印迹法检测opn-shRNA干扰质粒的opn基因沉默效果,筛选出对其基因沉默效果最显著的干扰靶位点;（2）脂肪组织特异性腺病毒载体（Ad-aP2-opn-shRNA）的构建:将前面筛选出的op n-shRNA序列片段连接于携带aP2特异性promoter的质粒构成重组质粒载体aP2-opn-shRNA,用限制性内切酶SacII/NheI分别对aP2-opn-shRNA和腺病毒载体Ad-MCS-SV40-EGFP进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒,并将此腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,产生重组腺病毒Ad-aP2-opn-shRNA,PCR鉴定及阳性克隆测序,并采用终点稀释法对腺病毒进行滴度测定;（3）腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA脂肪组织特异性的验证:分别将Ad-aP2-opn-shRNA感染至前白色脂肪细胞（3T3-L1）和脐静脉内皮细胞（HUVEC）,鉴于腺病毒载体中携带有绿色荧光蛋白（EGFP）标记,通过荧光倒置显微镜观察Ad-aP2-opn-shRNA感染二者细胞各自的荧光蛋白表达情况判断Ad-aP2-opn-shRNA的组织特异性;（4）腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA对3T3-L1前脂肪细胞分化为BA的影响:将腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA感染培养的3T3-L1前脂肪细胞,并将实验分成3组:?正常对照组（Control）、?阴性对照组（negative control,NC）、?腺病毒组（Ad-aP2-opn-shRNA）。一方面,采用油红O染色法观察3T3-L1白色前脂肪细胞诱导分化后细胞内脂质聚集情况;另一方面,通过Western blots检测BA相关特异性分子Marker—PRDM16及UCP-1等的蛋白表达水平来观察在含有diffe rentiation cocktail的培养基中对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为BA过程的影响;按照ELISA试剂盒所述方法检测Ad-aP2-opn-shRNA组感染后细胞培养基上清液sOPN的水平。结果:（1）成功构建三条opn-shRNA编码序列对应的重组质粒并筛选出沉默效率最佳的opn-shRNA编码序列即opn-shRNA-513;（2）经酶切鉴定及阳性克隆测序显示成功构建脂肪组织特异性腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA,并采用终点稀释法测得腺病毒滴度为1×1010PFU/ml;（3）Ad-aP2-opn-shRNA感染前脂肪细胞（3T3-L1）和脐静脉内皮细胞（HUVEC）后结果显示:3T3-L1细胞中荧光表达效率明显高于HUVECS细胞,表明腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA的脂肪组织特异性;（4）Ad-aP2-opn-shRNA感染3T3-L1细胞后,油红O染色结果显示:Ad-aP2-opn-shRNA组与Contrl组、NC组相比较,Ad-aP2-opn-shRNA组脂质油滴明显减少,并且脂滴状态也不明显,不具备棕色脂肪细胞样的多腔小脂滴形态;Western blots结果显示:Ad-aP2-opn-shRNA组与Control组、NC组的棕色脂肪细胞特异分子markers—PRDM16、UCP-1表达水平明显更低,有显著性差异（P<0.01）。结论:（1）成功构建了携带opn-shRNA的脂肪细胞特异性腺病毒载体Ad-aP2-opn-shRNA;（2）opn基因沉默对3T3-L1前脂肪细胞向棕色脂肪细胞的诱导分化有抑制作用,BA相关特异性分子markers表达量均下调,其可能的作用机制有待进一步探讨。