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自噬通过溶酶体降解生物大分子或细胞器用以维持细胞稳态,是生物体内一种重要的分解代谢过程,不同功能的自噬相关蛋白有序调控这一过程,在不同的生物体中进化出多样化的自噬信号通路。嗜热四膜虫中亲本大核程序性死亡（programmed nuclear death,PND）是一种独特的细胞核自噬,多种自噬相关蛋白可能参与调控PND过程。本研究从嗜热四膜虫中鉴定了Tt ATG4.1和TtATG4.4两种同源基因,并对这两种基因的功能进行了分析。主要结果如下:1.TtATG4.1和TtATG4.4生物信息学分析在四膜虫基因组数据库（http://www.ciliate.org）中进行同源序列比对发现4个C54肽酶家族蛋白,分别是TtAtg4.1、TtAtg4.2、TtAtg4.3和TtAtg4.4。四种自噬蛋白Atg4作为半胱氨酸蛋白酶均有保守的催化活性中心Cys,并且具有Atg4蛋白高度保守的GWGCM模体。Atg4蛋白的聚类与物种进化基本一致,嗜热四膜虫中的四种同源蛋白可能拥有不同的功能,在PND过程中有着各自的分工。其中TtATG4.1在有性生殖时期特异表达,在8h表达量最高;而TtATG4.4在有性生殖12 h表达量最高,这与亲本大核发生程序化降解的时间相吻合,暗示TtAtg4.1和TtAtg4.4可能参与调控PND。2.TtATG4.1参与PND过程亲本大核的降解为研究TtAtg4.1的功能,融合HA标签的过表达载体pXS75-ATG4.1转化四膜虫,筛选获得过表达Atg4.1细胞株。HA-Atg4.1定位于细胞质和程序化降解的亲本大核上。经Cd2+诱导HA-Atg4.1过量表达,不影响亲本大核核膜与自噬溶酶体的互融及正常酸化,但是促进了亲本大核降解,表明Atg4.1可能参与调控PND过程。进一步,我们构建了ATG4.1的RNAi干扰细胞株,RNA干扰ATG4.1引起亲本大核异常降解及发育延迟,自噬溶酶体好像逐步“分解啃食”亲本大核内容物,并且Atg8定位受到影响,部分Atg8蛋白弥散在细胞质中。敲减ATG4.1后可能影响了Atg8正常功能的发挥,导致Atg8与磷脂酰乙醇胺的结合受阻。3.TtATG4.4参与调控减数分裂小核和亲本大核的降解TtATG4.4在有性生殖2 h和12 h有高表达。我们构建了ATG4.4的RNAi干扰突变细胞株,ATG4.4敲减,抑制了小核减数分裂,有性生殖停止。融合HA标签的过表达载体pXS75-ATG4.4转化四膜虫,筛选获得过表达Atg4.4突变细胞株。免疫荧光定位表明HA-Atg4.4蛋白定位在在嗜热四膜虫有性生殖程序化降解的亲本大核上,经Cd2+诱导过量表达后,小核减数分裂产物的降解受到影响,在接合8 h仍能观察到未降解的减数分裂小核,而亲本大核在接合8 h未能正常移动到细胞后端,且亲本大核细胞核松散膨胀。结果表明Atg4.4可能既参与调控小核减数分裂,还参与调控PND过程亲本大核的降解。本研究首次鉴定了嗜热四膜虫自噬相关基因TtATG4.1和TtATG4.4,两种自噬相关基因均参与了PND中亲本大核的降解,而TtATG4.4基因可能调控自噬途径来影响小核减数分裂。这些结果表明Atg4.1和Atg4.4在功能上有不同的分工。这些自噬相关基因的鉴定为进一步了解PND过程的降解机制以及自噬相关蛋白在其中发挥的功能奠定了基础。