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PRRT2相关疾病(PRRT2-associated disorders)是以PRRT2基因变异为共同分子基础的一类常染色体显性遗传性疾病,主要包括发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD)、良性家族性婴儿癫痫(benign familial infantile seizures,BFIS)、婴儿惊厥伴舞蹈手足徐动症(infantile convulsions with choreoathetosis,ICCA)、偏瘫性偏头痛(hemiplegicmigraine,HM)、发作性共济失调(episodicataxia,EA)等。原发性 PKD是PRRT2相关疾病最常见的表型。目前为止,已经发现了 100多种PRRT2变异,包括无义变异、错义变异、小片段插入/缺失、剪切位点变异等。90%以上变异可导致终止密码提前出现,是PRRT2基因最常见的致病变异类型。携带错义变异的病例远远少于携带截短变异的病例,对错义变异蛋白的功能研究也寥寥无几,多数错义变异与PRRT2相关疾病的关系仍不明确,给疾病的诊治带来困难。PRRT2是中枢神经系统特异性表达的膜蛋白,通过调节神经元的突触传递和Na+离子通道功能影响神经元的兴奋性。截短变异导致蛋白表达水平下降,亚细胞定位异常。单倍体剂量不足可能是PRRT2相关疾病发生的病理机制。有研究发现2种错义变异(p.A287T和p.R308C)的蛋白表达下降或弥散到细胞浆中。我们团队前期对另2种错义变异(p.R266W和p.G305R)的研究则未发现这种改变。2016年,我们团队利用PKD患者尿上皮细胞构建了诱导多能干(inducedpluripotentstem,iPS)细胞,但发现该细胞向神经元分化的周期长,分化效率较低。有文献表明,iPS细胞携带其原始体细胞的表观遗传记忆,可能对分化等细胞特性有一定影响。目前报道的PKD患者iPS细胞模型的原始体细胞多为皮肤成纤维细胞。本研究中,我们对2017年12月以前国内外报道的PRRT2错义变异进行细胞功能实验,根据 American Col lege of Medical Genetics and Genomics(ACMG)指南对错义变异位点的性质进行判定。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,我们进一步筛查PRRT2调控区域序列的变异,并进行相关的功能实验,以探讨这些变异的致病性。同时,我们从变异蛋白的降解角度对PRRT2致病机制进行初步探索,并培养携带PRRT2热点变异患者的皮肤成纤维细胞,重编程为iPS细胞,为进一步探索PRRT2的病理机制奠定了基础。第一部分PR尺T2错义变异的致病性分析目的:通过体外细胞功能实验,评估PRRT2相关疾病中发现的错义变异的致病性。方法:对2017年12月之前国内外报道的PRRT2错义变异进行系统性文献回顾和总结。构建N端含EGFP的真核表达载体,进行体外细胞转染实验。免疫印迹法观察PRRT2蛋白水平变化,在共聚焦显微镜下观察蛋白亚细胞定位变化。根据ACMG指南分析变异的致病性。结果:PRRT2错义变异共29个。有10个错义变异蛋白同时存在蛋白水平减低和蛋白异位,3个变异仅改变蛋白的细胞膜定位,2个变异仅出现蛋白表达水平减低。经过ACMG分类,有 15 个变异(p.S275F、p.P279L、p.W281R、p.A287T、p.A291V、p.R295Q、p.G305W、p.A306T、p.A306D、p.R308C、p.S317N、p.G323R、p.G323E、p.G324R 和 p.G324E)为可能致病变异,3个变异(p.P138A、p.D147H和p.P216L)为良性变异,3个变异(p.S208Y、p.A214P 和 p.P215R)为可能良性变异,而 8 个变异(p.E177K、p.P216R、p.P216H、p.R266W、p.R266Q、p.G305R、p.R311W 和 p.I327M)为意义未明确变异。结论:在已报道的PRRT2错义变异中,51.7%(15/29)的变异可以导致PRRT2相关疾病。致病性变异主要集中在PRRT2蛋白C端,提示该区域具有重要的生理功能。第二部分PRRT2基因UTR变异在PKD中的作用探讨目的:对P尺RT2编码区检测阴性的PKD患者筛查PRRT2 UTR变异,并探讨其致病性。方法:收集PRRT2编码区测序阴性的PKD病例85例,筛查UTR变异。然后构建包含UTR变异的质粒表达载体,进行细胞转染,利用实时荧光定量PCR检测mRNA水平变化,免疫印迹法检测蛋白水平的改变。结果:在85例先证者中,分别在2例患者的3’UTR检测到了 c.*933A>G和c.*978A>G杂合变异,5’UTR未检测出异常。体外细胞实验发现,3’UTR可以明显下调mRNA水平,进而下调蛋白的表达。而c.*933A>G和c.*978A>G变异减弱了 3’UTR的下调能力,在一定程度上调了 PRRT2的mRNA和蛋白水平。结论:PRRT2蛋白功能增加也可能导致疾病的发生。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,还需进一步筛查UTR变异。第三部分PRRT2变异蛋白的致病机制初步探索目的:初步探讨PRRT2变异蛋白的致病机制,并建立人成纤维细胞来源的携带PRRT2热点致病变异的iPS细胞模型。方法:将PRRT2热点致病变异及野生型表达载体转染细胞,用蛋白酶体或溶酶体降解抑制剂乳胞素或3-MA分别进行干预,用免疫印迹法检测PRRT2蛋白变化。利用液相色谱-质谱分析联合免疫共沉淀寻找可能参与PRRT2降解的关键蛋白。培养携带PRRT2热点致病变异的人皮肤成纤维细胞,利用仙台病毒重编程试剂盒建立iPS细胞模型,分化为神经元,免疫印迹法检测神经元中PRRT2蛋白水平的改变。结果:乳胞素和3-MA分别干预后,PRRT2变异蛋白增加较野生型蛋白都增多。PRRT2变异蛋白通过蛋白酶体和溶酶体途径降解。PRRT2与E3泛素连接酶AMFR存在相互作用。成功构建携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞,并分化为神经元,蛋白水平检测发现PRRT2变异蛋白显著下降。结论:PRRT2变异蛋白降解增多导致蛋白水平的下降。携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞是研究PRRT2病理机制的理想模型之一。