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恶性黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤，临床上迫切需要新型的治疗策略。治疗性疫苗作为一种极具发展前景的生物治疗方法，目前临床有效率仍较低。PD-L1：PD-1负性调节通路参与了恶性黑素瘤的免疫逃逸，本研究探讨利用注射PD-1Ig编码质粒阻断该通路以提高TRP-2肽疫苗治疗小鼠黑素瘤治疗效应的可能性，并在TRP-2180-188特异性CD8+T细胞水平分析其作用机制。
第一部分PD-1Ig编码质粒的构建与大规模制备目的构建并大规模制备PD-1Ig编码质粒，为后续研究创造条件。方法：用TMpred软件和UniProt蛋白质数据库预测小鼠PD-1胞外域，RT-PCR克隆其编码序列，构建PD-1Ig编码质粒：测序验证后，分别应用ELISA和RT-PCR方法检测其体内外表达情况；最后应用QIAGEN EndoFree PlasmidGiga Kit大规模制备pPD-1Ig质粒及阴性对照质粒pig-tail。结果预测小鼠PD-1分子残基1-20为信号肽，残基169-170为跨膜结构的起点可能性大。成功扩增小鼠PD-1胞外域(残基21-168)的编码基因，并克隆至pIg-tail中。pPD-1Ig和pig-tail质粒分别转染B16F10细胞，ELISA检测培养上清中PD-1Ig和Ig-tail浓度分别为17.53 ng/mL和21.8l ng/mL。注射pPD-1Ig和plg-tail质粒1d、3d后均扩增出与预期大小相符的DNA片段。结论成功构建了pPD-1Ig真核表达载体，证实其能在体内外表达，并为后续研究大规模制备了pPD-1Ig和pig-tail质粒。
第二部分 pPD-1Ig对小鼠黑素瘤TRP-2肽疫苗治疗效应的影响目的探讨pPD-1Ig对小鼠黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗治疗效应的影响。方法：以小鼠B16F1O黑素瘤皮下移植瘤为模型，以未治疗组、单用TRP-2180-188肽疫苗组、TRP-2180-188肽疫苗联合pig-tail质粒组为对照，以成瘤率、肿瘤生长速度、生存曲线为观察指标，研究了pPD-1Ig对TRP-2180-188肽疫苗治疗的影响。结果与单用TRP-2180-188肽疫苗组相比，联合应用pPD-1Ig能显著推迟B16F10皮下移植瘤的形成(中位天数：10 vs 13，P=0.0354)、抑制其生长(D16，D19时肿瘤大小的中位数为：39.43 vs 13.74 mm2，90.83 vs 38.83 mm2。P值分别为0.0102，0.0029)，并延长荷瘤小鼠的存活(中位生存时间：25 d vs 29.5 d,(P=0.0349)。另外，自D16开始，TRP-2肽疫苗联合pPD-1Ig组小鼠皮下移植瘤也明显小于TRP-2肽疫苗联合pIg-tail组(D16，D19时肿瘤大小：13.74 vs 31.19mm2，38.83 vs 59.47 mm2； P值分别为0.0120，0.0141)。 结论应用pPD-1Ig阻断PD-1负性信号通路，可显著增强TRP-2180-188肽疫苗治疗小鼠黑素瘤的疗效。
第三部分 pPD-1Ig对TRP-2肽疫苗治疗效应影响的机制分析目的在TRP-2特异性CD8+T细胞水平，分析pPD-1Ig对TRP-2肽疫苗治疗效应影响的机制。方法：制备H-2KbTRP-2/SVY四聚体，通过应用该四聚体，结合相应荧光抗体，对TRP-2特异性CD8+T细胞的频率、PD-1表达、CD62L，CD127表达情况进行分析。结果 (1)成功制备H-2Kb TRP-2/SVY四聚体；(2)TRP-2180-188肽疫苗联合pPD-1Ig组小鼠外周血TRP-2/SVY特异性CD8+T细胞频率，在D11和D25均显著高于单用TRP-2180-188肽疫苗组(P值均<0.05)，与联合应用pIg-tail组相比虽然频率有所增加，但差异并无显著性(P值均>0.05)。(3)各免疫治疗组小鼠外周血TRP-2/SVY特异性CD8+T细胞PD-1表达率在免疫治疗D25时较D11时均显著升高(P值均<0.01)，但在各治疗组之间，其表达并无显著性差异(P值均>0.05)。 (4)免疫治疗D11时，pPD-1Ig使接受TRP-2180-188肽疫苗治疗小鼠外周血TRP-2抗原特异性CD8+T细胞中的效应T细胞(Teff细胞，CD62L-CD127-)比例增高，中央型记忆T细胞(Tcm细胞，CD62L+CD127+)比例降低(P值均<0.05)，但效应型记忆T细胞(Tem细胞，CD62L+CD127-)比例无显著变化(P>0.05)。但免疫治疗D25时，各治疗组间外周血TRP-2抗原特异性CD8+T细胞中Teff、Tem、Tcm细胞所占比例并无显著差异(P值均>0.05)。结论 PD-1Ig可使接受TRP-2肽疫苗治疗的B16F10荷瘤小鼠外周血中TRP-2抗原特异性CD8+T细胞的频率增加，并扩大效应细胞(Teff)细胞的比例，从而增强TRP-2肽疫苗的治疗效应。