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皮肤黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤，对高级别的黑素瘤临床常规治疗效果不佳。免疫治疗尤其是联合免疫治疗是国内外研究的热点，其中PD-1通路和Tim-3通路起负性免疫调节作用，参与肿瘤的免疫逃逸，其相关的免疫药物已经在黑素瘤的治疗中显示了很好的临床疗效。本研究探讨体外联合Tim-3Ig和PD-1Ig对TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响，为黑素瘤的免疫治疗提供理论基础和实验依据。 第一部分 Tim-3Ig真核表达载体的构建及表达 目的:构建Tim-3Ig真核表达质粒并获取含Tim-3Ig、PD-1Ig和Ig-tail的上清，为后续实验做好准备。 方法:生物信息学方法分析小鼠Tim-3分子结构，优化基因表达序列，将合成的序列连接至载体质粒，构建Tim-3Ig重组质粒，进行酶切及测序验证，用脂质体方法转染质粒至人肾上皮细胞293T中，收取上清进行蛋白免疫印迹(western blot)检测，细胞进行激光共聚焦检测，分析蛋白表达情况，并制备含Tim-3Ig的上清。用本课题组已经制备保存的pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2和pFUSE-PD-1-mIgG2Aae1-Fc2质粒采用相同方法制备含Ig-tail和PD-1Ig的上清。 结果:预测小鼠Tim-3分子1-19为信号肽，20-193为胞外域，194-214为跨膜域。酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中，western blot和激光共聚焦检测到转染重组质粒在293T中的表达。 结论:成功构建小鼠Tim-3Ig基因真核表达质粒且能在真核细胞中表达，并为后续研究提供含Tim-3Ig、PD-1Ig和Ig-tail的上清。 第二部分 TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL6小鼠及B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系的构建 目的:构建B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系，为后续实验做好准备。 方法:以全部硫代修饰的CpG-ODN1826和弗氏不完全佐剂为佐剂构建TRP-2180-188肽疫苗，并对C57BL/6小鼠进行3次初次免疫及1次加强免疫，取其脾淋巴细胞并进行TRP-2180-188抗原肽体外刺激，与小鼠黑素瘤B16F10细胞体外共培养。 结果:体外经TRP-2180-188抗原肽刺激的脾淋巴细胞随培养时间延长，逐渐出现集落性增殖，并且出现体积增大、胞核大、胞浆丰富的细胞;与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的脾淋巴细胞随培养时间的延长，逐渐出现向B16F10细胞周围聚集的现象。 结论:成功构建B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系。 第三部分Tim-3Ig联合PD-1Ig对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响 目的:探讨Tim-3Ig联合PD-1Ig对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。 方法:在小鼠黑素瘤B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽特异性刺激的小鼠脾淋巴细胞共培养体系，实验设五组:空白对照组、阴性对照组、PD-1Ig组、Tim-3Ig组、Tim-3Ig联合PD-1Ig组，CCK-8法检测24h、48h时淋巴细胞增殖情况，ELISA检测24h、48h上清中INF-γ、TNF-α分泌情况，流式细胞仪分析24h、48h时CD8+T淋巴细胞频率。 结果: Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h淋巴细胞增殖活性与对照组、PD-1Ig组无显著性差异（P＞0.05），高于Tim-3Ig组（P＜0.05）;48h增殖活性低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h、48h上清中IFN-γ和TNF-α浓度均低于其他各组（P＜0.05）。Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h、48hCD8+T淋巴细胞频率低于PD-1Ig组、Tim-3Ig组（P＜0.05），高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。 结论:体外Tim-3Ig联合PD-1Ig对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的增殖和IFN-γ、TNF-α分泌起抑制作用。