研究背景我国实行改革开放以来,航海事业迅速发展,随着我国海军走向深蓝,各种反恐作战、打击海盗、海上救援等活动日益增多,海上作业人员遭受意外创伤、烧伤、海难的风险随之增加。烧伤患者遭受海水浸泡后不仅心、肝、肺、肾等重要器官会发生明显病理学改变,烧伤创面也同样可以加重损伤。以往实验研究发现对海水浸泡后大鼠烧伤创面的内皮细胞损伤、微循环障碍等进行研究,提出了早期创面处理原则及方案,虽然实验证实淡水冲洗能够减轻损害程度,但方法仍显不足。海水浸泡加深创面的主要原因为高渗、高钠、高氯、高含菌量、低温、偏碱性等特殊的理化性质,其加重了烧伤创面微循环障碍,加重的组织水肿程度,使创面进行性加深,坏死范围增大,治疗难度增加。烧伤后大量清水肿液漏出导致的局部组织水肿,组织肿胀使细胞间隙增大,对细胞间的物质交换造成阻碍。压迫局部微血管对组织灌注造成阻碍,引起创面缺血低氧,阻碍创面愈合。压迫创伤局部的淋巴管,使回流障碍,加重组织水肿。负压施加于创面后,可以及时地清除渗出物,减少局部渗出液体在创面的积聚。同时负压作用于烧伤创面,可有效地减少渗出的血清和水肿液漏出到烧伤创面的淤滞带和凝固带,从而减轻局部组织水肿,防止烧伤创面的进行性加深。烧伤创面循环障碍以及所引起的组织缺血缺氧是影响创面愈合的原因之一,微血管栓塞、血流不畅,导致氧气及修复创面所需营养难以到达损伤创面,而创面细胞破坏产生的碎片及炎症物质不能及时被转运出来。有动物实验发现负压封闭引流治疗后局部创面血管的直径扩大、血管的分布密度增加,负压创面血流灌注增加,且创伤修复的不同过程中血流量有不同的变化。肝素是一种氨基葡聚糖(GAG),在体内及体外均可发挥强效抗凝血作用,肝素抗凝、溶栓的机理是通过与抗凝血酶结合及激活肝素辅助因子,催化灭活多种凝血因子,产生抗凝活性。临床观察发现,肝素应用于烧伤创面后可加快缺血组织血液供应的恢复。在使用24小时后即有血管再生征象,首先在烧伤后发白的皮肤表面出现散在细小红点,随着红点数量及密度的增加,逐渐形成血管床,并逐渐建立血液循环,烧伤后发生瘀滞、栓塞的缺血组织逐渐被血供丰富的肉芽组织取代。本研究在以上此理论及实验研究基础上,设计动物实验,将封闭负压引流及肝素溶液湿敷治疗技术应用于海水浸泡的新西兰大白兔烫伤创面。通过观察病理学改变、微血管计数、创面愈合时间、组织含水量等指标,为研究海水浸泡后烫伤创面的病理改变以及负压封闭引流、肝素灌洗对其产生的影响提供实验参考,也为临床治疗海水浸泡烧伤创面的治疗提供新的思路及参考。目的探讨负压封闭引流联合肝素溶液灌洗对兔烫伤合并海水浸泡创面病理改变及愈合过程的影响。方法1、实验动物及分组方法:清洁级新西兰大白兔20只,体重2.0kg-2.5kg,雌雄不限,兔龄3到4个月。按照体重使用随机数字表分为4组,分别在第1、3、5、7天取材,每组5只。2、致伤及实验方法:术前24小时以3%戊巴比妥纳溶液根据体重作耳缘静脉麻醉,用量为30 mg/kg。80 g/L硫化钠溶液进行背部脱毛。麻醉后将各组动物四肢固定,将已脱毛区域使用记号笔画线标记,用4cm×4cm大小36层经99 ℃恒温水浴浸泡的纱布平铺于烫伤部位,时间持续17s,造成实验动物4个1%TBSA深Ⅱ度烫伤创面(病理切片证实)。根据抽签随机分组,将其中3个创面给予海水浸泡2小时,另外1个创面在空气中暴露2小时。处理方法:暴露组创面给予常规换药治疗(a组,对照组)。海水浸泡的3组创面分别给予常规换药治疗(b组)、单纯负压吸引治疗(c组)、负压吸引合并肝素治疗(d组)。负压引流创面(c、d组)每日给予生理盐水冲洗1次。d组创面冲洗后,经管路给予5000U/ml肝素溶液3ml浸湿负压引流敷料,湿敷1小时后启动负压吸引装置,继续封闭负压吸引治疗。压力设定在-100mmHg,模式设置为负压吸引持续5分钟,间隔2分钟。3、检测指标及方法:分别于伤后的第1、3、5、7天抽取5只动物,3%戊巴比妥纳麻醉后打开敷料,观察创面肿胀及坏死组织脱落情况;各创面切取组织标本分别进行光镜病理学观察、免疫组化观察、电镜观察;切取组织利用干湿比重法测量创面组织含水量。取材后各创面继续取材前治疗方式处理至伤后第14天,所有创面常规换药并饲养至创面愈合。4、统计学处理:所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析,数值用均数加减标准差(x±s)表示,计量资料的比较采用重复测量方差分析,多重比较用LSD法(方差不齐用DunnettT3法)。等级资料用数值变量(N)表示,两个样本之间的比较采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为有统计学意义。结果1、创面大体观察烫伤后第1天,各实验组创面均有不同程度水肿,常规换药组(a组)创面表面较干燥,海水浸泡组(b组)创面较为干枯,创面有加深倾向,切开取材时见痂下组织水肿明显。常规封闭负压引流组(c组)及联合治疗组(d组)创面表面较另两组显湿润。伤后第3天观察,各组创面仍有肿胀,a、b组创面基底可见坏死组织附着,b组创面基底可见明显坏死灶,c、d组创面表层坏死组织较少,基底较新鲜、红润,但取材切开时见组织内水肿仍较明显。伤后第5天,a组创面表面结有薄层痂皮,b组创面加深明显,表面坏死组织结成厚痂皮,c、d组创面基底较湿润,无明显痂皮,d组创面坏死组织较c组少,并更为红润。伤后第7天观察,见a组创面坏死组织逐渐溶痂,少量液化坏死组织附着,b组创面坏死组织较厚,可见少量脓性分泌物,c、d组创面坏死组织部分脱落,基底较新鲜,部分创面上皮化。伤后第14天,a组创面愈合约55%,残余创面结痂、干燥,b组创面基底仍有较厚的痂皮附着,基底仍略水肿,c组创面大部分愈合,新生表皮新鲜,残余创面结有薄层痂皮。d组创面约80%愈合,痂皮脱落,残余少量创面。2、创面组织病理学观察(HE染色)伤后第1天HE染色观察,见各组创面表皮均有脱落及坏死,真皮较水肿,炎症细胞浸润,可见微血管扩张及少量炎症细胞浸润,以b组最明显,可见大量红细胞外渗到组织间。伤后第3天观察,见a、b组创面组织仍水肿明显,微血管仍扩张,管腔内可见大量栓塞的红细胞,真皮层组织坏死,炎症细胞浸润明显,c、d组创面胶原纤维水肿程度较a、b组轻,d组切片炎症细胞浸润程度及红细胞外渗情况较其他组轻。伤后第5天观察,见各组创面组织水肿均较前减轻,a、b、c组切片内仍可见大量炎症细胞浸润,胶原纤维水肿伴坏死,可见破裂血管及外渗红细胞聚集,d组创面炎症细胞较少,胶原纤维水肿程度较轻。伤后第7天观察,可见各组创面组织内炎症细胞较前减少,仍可见血管扩张、充血,各组创面均可见新生血管。c、d组新生血管较a、b组多,d组创面及毛囊内出现新生鳞状上皮。3、电子显微镜观察a组切片内可见血管腔内红细胞皱缩、堆积,内皮细胞尚完整,内皮细胞的间隙增宽,细胞内线粒体中出现空泡,可见较完整核糖体。b组切片内观察见毛细血管基膜部分消失,血管管腔内可见明显皱缩变形的红细胞,内皮间隙明显增大,细胞间的边界不清,部分内皮细胞坏死,部分内皮细胞呈凋亡表现,残存内皮细胞的胞质明显减少。c组切片内可见毛细血管内皮基膜较完整,细胞间隙增宽,可观察到细胞间连接打开。部分内皮细胞出现凋亡现象,内有空泡,可见自噬体形成。d组切片内观察到毛细血管基膜完整,腔内可见散在红细胞,内皮细胞尚完整,染色质聚集到核膜下,细胞间隙增宽。4、创面组织含水量各组创面组织不同时间点的组织含水量统计结果显示,a、b、c、d各分组间之间差异有统计学意义,(F=94.07,P<0.05)。不同时相点间各组差异有统计学意义(F=236.3,P<0.05)。在伤后第1天,a组创面含水量最低,表明海水浸泡后的三组创面水肿程度高于单纯烫伤组。伤后第3天,各组创面组织含水量达到峰值,后逐渐下降。至伤后第5天,c、d两组创面组织含水量下降至接近第1天水平,其中d组下降最明显且含水量最低,b组含水量在各组间相比仍最高,c、d组含水量已经低于a组。5、创面血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor)表达阳性率免疫组化染色切片观察结果显示,VEGF的表达主要分布于血管、毛囊及创面基底部的细胞中。在伤后第1天,b组创面内VEGF表达阳性程度最高,分析原因可能是组织损伤程度最高引起。从第3天开始,可观察到c、d两组创面VEGF阳性程度快速增加,视野内颗粒呈棕黄色的细胞明显增多,d组VEGF阳性表达的细胞密度最高,并持续至第5天。至第7天观察时,a、b组VEGF表达略有减弱,c、d组内仍呈现高表达状态。6、微血管密度(micro-vascular density,MVD)检测组织内微血管密度(MVD)变化规律类似于VEGF表达规律,其CD31染色的阳性信号主要定位于胞浆中。伤后第1天观察,见各组创面血管密度无明显差异,第3-7天观察见各组创面血管密度均逐渐增加,d组各时相点MVD均最高,b组最低,各组间差异有统计学意义(F=123.36,P<0.05)。在微血管生成时间上看,d组新生血管出现最早,且高峰值最高,b组微血管生成较晚且密度低。不同时间点间差异有统计学意义(F=952.75,P<0.05)。结论1、海水浸泡可加重兔烫伤创面内皮细胞损伤,加重微循环障碍。2、负压封闭引流治疗联合肝素溶液湿敷治疗,可有效地减轻海水浸泡后烫伤创面的组织水肿程度,改善组织微循环,加快坏死组织的清除,促进新生血管的生长,是治疗海水浸泡后烧烫伤创面的有效手段。