豆豉溶栓酶原料药生产工艺及酶学性质研究

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血栓性疾病现已成为人类健康的第一大杀手,溶栓治疗是最安全、有效的疗法,但目前临床使用的溶栓药物都存在一定的副作用,且价格昂贵,研制高效、无副作用,廉价的新型溶栓药物需求迫切。从中国传统发酵食品——豆豉中发现的豆豉溶栓酶(DFE)不仅具有溶解血栓的功能,而且作用直接迅速、持续时间长、安全性好,可由微生物发酵生产造价低廉,有望弥补现有溶栓药物的缺陷,具有开发为新型溶栓药物的巨大潜力。 本实验室已从豆豉中筛选到一株溶栓酶高产菌——HGD107,本研究是在该菌株摇瓶发酵试验的基础上,用15L全自动发酵罐进行DFE生产工艺放大试验,研究该酶的最适发酵工艺、最适提取工艺及主要酶学性质,为工业化生产新型溶栓酶制剂提供依据。最终研究结果如下: 发酵的最适工艺条件:种子最适种龄为10h,二级种子扩大培养时,摇床转速为180r/min,接种量为6%。发酵培养基配方:豆粕粉4%,大米粉2%,K2HPO40.4%,KH2PO40.2%,MgSO40.07%,CaCl20.04%,初始pH为7.5。发酵温度为32℃,通风量为10L/min,起始搅拌转速为200r/min,发酵4h左右,溶氧浓度迅速降低时,提高到400r/min,至发酵结束。最适发酵时间为72h,发酵液酶活最高达2050.4u/mL。 提取的最适工艺条件:在室温,料液pH自然的条件下,发酵液先离心固液分离,上清液再经D392离子交换树脂脱色,脱色液用硫酸铵进行分级盐析,盐析沉淀经超滤脱盐,真空冷冻干燥制得DFE成品为灰白色干粉,比活力为253.0u/mg,纯化倍数为11.0,活性回收率为65.7%。 DFE的酶学性质研究结果:SDS-PAGE凝胶电泳测定DFE的分子量为31.0KD。DFE的最适作用温度为42℃。在37℃保温1h活力保持在90%以上;50℃保温1h活力保持在80%左右;60℃保温1h迅速失活,活力仅剩10%。DFE的最适作用pH为8.0。DFE最稳定的pH范围是6-9,4℃下放置24h,酶活保持在80%以上。模拟胃环境条件(pH2-3)下,胃蛋白酶能水解DFE。
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