PRRSV感染骨髓组织实时定量PCR内参基因的选择及ASAH1基因表达影响研究

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目的:内参基因作为RT-PCR反应体系中的内源性参照,起到标准化对定量数据的重要作用。但是在PRRSV感染条件下的骨髓中,常见内参基因表达有可能发生改变,因此需要筛选稳定表达的基因作为内参。本实验室建立了PRRSV感染骨髓组织的数字化基因表达谱,通过生物信息学分析筛选得到差异表达的基因酸性神经酰胺酶ASAH1,并初步探索PRRSV感染过程中ASAH1与病毒和宿主的相互作用,为更好地理解PRRSV感染的分子机理提供参考。方法:采用荧光定量技术检测9个常用内参基因在PRRSV感染骨髓中的表达差异,并应用geNorm软件评估基因的表达稳定性;采用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测ASAH1基因在PRRSV感染条件下表达水平的影响。结果:在PRRSV感染的骨髓组织中,β-actin是表达最稳定的基因,而Bm2是表达最不稳定的基因,稳定性由高到低依次为β-actin>GAPDH>SDHA>5S>18S>TOP2B> HPRT>PKGl>Bm2;差异表达的基因ASAH1,在数字化基因表达谱中显著上调:荧光定量PCR结果显示ASAH1基因转录水平显著上调;免疫印迹检测显示ASAH1蛋白表达水平显著上调。结论:β-actin是PRRSV感染骨髓组织中表达最稳定的内参基因,与部分非PRRSV感染内参基因稳定性研究结果不同,β-actin是该条件下最适宜的内参基因。ASAH1的自然底物神经酰胺是鞘磷脂途径信号系统的中心分子,ASAH1依靠水解神经酰胺可以影响NF-κB信号途径,ASAHl的上调表达可能在PRRSV感染引起的细胞凋亡和炎症反应中扮演着重要角色,但其具体的作用和机制有待进一步的探究。
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