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唑类药物抑制麦角甾醇合成,被广泛用于真菌性疾病和真菌性植物病害的治疗和防控,但长期使用导致了耐药性的产生。真菌中一系列基因(包括唑类药物外排泵和药物靶标基因)能对唑类药物产生适应性转录响应,促进真菌在唑类药物胁迫下存活。此胁迫响应是耐药性产生的基础,而关于真菌是如何感知和传递唑类药物的胁迫信号从而来激活这一胁迫响应的机制还不完全清楚。 本研究以粗糙脉孢菌为模型,通过表型鉴定、基因表达分析、甾醇含量分析等方法,发现唑类药物作用下积累的麦角甾醇中间代谢物是激活唑类药物胁迫响应的原因,并鉴定了唑类药物胁迫信号传导途径中的一个新的元件激酶STK-17,解析了其参与调控唑类药物胁迫响应的机制,为唑类药物胁迫响应的调控提出了新机制,提供了新思路。主要结果概括如下: 1、建立了唑类药物外排泵基因的表达与麦角甾醇合成之间的调控关系。本研究构建了由铜离子响应启动子P tcu-1控制erg11(唑类药物靶标编码基因)表达的突变体,发现在没有唑类药物的情况下,抑制erg11的表达就可激活唑类药物响应基因的表达,包括唑类药物外排泵CDR4的编码基因,说明唑类药物外排泵基因在唑类药物作用下的转录激活是麦角甾醇合成受阻所致。 2、证明麦角甾醇合成减少不是激活唑类药物胁迫响应的因素。erg11表达的抑制以及其它麦角甾醇合成基因erg2、erg4、erg5的敲除都能使麦角甾醇合成减少或缺失,但erg2的敲除仅诱导了cdr4和erg24的表达,而erg4和erg5的敲除不诱导基因表达,说明麦角甾醇合成减少不是激活唑类药物胁迫响应的原因。 3、发现甾醇中间代谢物的积累激活了唑类药物胁迫响应。erg2的敲除和erg11表达的抑制激活了不同基因的转录响应,而且用药物抑制麦角甾醇合成途径中的不同步骤也诱导了不同麦角甾醇合成基因的转录响应。甾醇含量分析发现,不同的转录响应与积累的不同甾醇中间代谢物存在关联性。进一步,在erg2敲除株中进行酮康唑的处理改变了erg2敲除株中积累的甾醇,也改变了基因的表达,尤其是erg24的表达,说明是积累的甾醇中间代谢物激活唑类药物胁迫响应。 4、发现了影响唑类药物敏感性的新激酶STK-17。stk-17基因对唑类药物存在转录响应,其敲除可导致粗糙脉孢菌对多种唑类药物和氧化胁迫的超敏感。激酶活性位点突变也可导致对唑类药物的超敏感,说明STK-17作为激酶参与调控。STK-17蛋白序列在真菌中高度保守;轮枝镰刀菌STK-17同源蛋白Ran1编码基因敲除后导致了对多唑类药物和氧化胁迫的超敏感;烟曲霉STK-17同源蛋白Ran1编码基因的敲除虽不会导致超敏感的表型,但其基因可以回补粗糙脉孢菌stk-17敲除株的表型。 5、发现STK-17调控麦角甾醇合成基因对唑类药物的响应并影响胞内唑类药物积累。RNA-seq分析显示敲除stk-17影响了粗糙脉孢菌对唑类药物的胁迫响应,其中参与麦角甾醇合成的基因所受影响突出,同时stk-17敲除导致唑类药物处理下的甾醇中间代谢物积累出现异常。此外,stk-17敲除导致胞内积累更多的唑类药物,但stk-17和cdr4的双敲除突变株表现出唑类药物作用下的合成致死效应,说明二者无调控关系,而STK-17调控非药物外排泵介导的药物积累。 6、发现了STK-17特异调控麦角甾醇相关的膜过程。erg11的过表达增强了stk-17敲除菌株对唑类药物和氧化胁迫的耐受性,但并不影响野生型对氧化胁迫的耐受性。因erg11参与细胞膜甾醇的合成,该结果表明敲除stk-17可能导致了膜损伤。RNA-seq数据表明stk-17敲除影响了膜相关基因的表达,包括与甾醇合成和调控相关的idi1和insig基因,说明stk-17影响的膜过程和甾醇有一定联系。此外,stk-17敲除仅导致粗糙脉孢菌对麦角甾醇合成抑制剂的敏感性而不改变对其它细胞膜损伤的敏感性,说明其敲除特异地影响了甾醇合成相关的膜过程。麦角甾醇合成基因的敲除则可以导致类似于stk-17敲除后的超敏感和药物积累等表型。因此,STK-17通过特异性影响甾醇相关的膜过程来影响真菌对唑类药物的胁迫响应。