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目的:柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）感染所致的病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）严重危害人类健康,也是新生儿猝死的重要原因,目前尚无有效的预防方法。核酸疫苗的问世,为建立有效的预防方法提供了机会。本室前期的大量研究证明,以pcDNA3质粒为载体构建的多种核酸疫苗免疫小鼠后,仅可诱导产生低效价的中和抗体,不能有效阻止致死量病毒感染。因此,提高免疫原性、增强免疫效果是制备CVB3疫苗亟需解决的问题。目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中,复制缺陷型腺病毒载体系统（Replication-Defective Adenovirus Vector System）以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点,在疫苗载体选择中表现出优势,成为极具应用前景的基因转移载体。VP1是CVB3的主要中和抗原,能诱导机体产生体液和细胞免疫,但用VP1基因构建的核酸疫苗免疫小鼠后产生的中和抗体效价偏低。其主要原因是VP1蛋白在转染细胞中可以表达,但却不能从转染细胞中自主释放,因而不能有效激发抗体应答。人白细胞介素2（Human interleukin-2, hIL-2）信号肽是由20个氨基酸组成的高度疏水性序列,它可以将合成的蛋白质移向细胞膜并与细胞膜结合,然后把合成的蛋白质分泌到胞外,且可以在不同种属蛋白质间相互使用。本室前期曾将CVB3 VP1基因拼接到人白介素2（hIL-2）信号肽5’端构建了分泌性重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1,免疫小鼠可以增强中和抗体应答。本研究利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒Ad/sVP1,并通过研究该疫苗免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用探讨这种疫苗的应用效果。方法: （1）目的基因的扩增与鉴定以重组质粒pcDNA3/sVP1为模板,扩增带有信号肽的VP1基因。将扩增产物与pGEM-T载体连接,构建质粒pGEM-T/sVP1。转化DH5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序,筛选重组子。（2）重组穿梭质粒的构建将质粒pGEM-T/sVP1以合适的限制性内切酶进行双酶切,回收带粘末端的目的片段,将目的片断分别与经合适的限制性内切酶双酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接。经转化、筛选和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1。（3）重组腺病毒质粒的构建将质粒用内切酶PmeⅠ线性化。利用AdEasy系统,经两步法分别在大肠杆菌BJ-5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1。用PacⅠ酶切鉴定。将阳性质粒转化入感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取,并用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）沉淀法进行纯化。（4）重组腺病毒Ad/sVP1的包装与扩增将重组腺病毒质粒pAd/sVP1用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293（humanembryo kidney 293 derived cell line）细胞,并观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293细胞,逐日观察细胞病变（cytopathic effect,CPE）,及有否彗星样斑块（FOCI）形成。并经第三轮大量扩增,以提高病毒滴度。（5）病毒感染293细胞后48小时,提取细胞总蛋白及细胞培养液,通过SDS-PAGE和Western blot检测VP1蛋白的表达。（6）大量扩增重组腺病毒取Ad/sVP1以及本室保存Ad/VP1第三代病毒液感染293细胞,大量扩增重组腺病毒,并以冻融法收集病毒液。将收集到的病毒液利用大量腺病毒纯化试剂盒纯化病毒。（7）重组腺病毒滴度测定待293细胞在96孔板中生长至70-80%汇合时,以不同稀释倍数的上述病毒液感染细胞,感染后48小时GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量。（8）动物实验:将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为PBS对照组、Ad/VP1组、Ad/sVP1组,每组18只,病毒液以PBS稀释后,股四头肌注射免疫小鼠,每次每只接种1×107pfu,第0、16天分别免疫,共免疫2次;每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）及ELISA法检测血清CVB3特异性中和抗体和IgG抗体水平;第2次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）杀伤活性的检测;另每组12只小鼠用4LD50CVB3进行腹腔注射,观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天取血,用于血中病毒滴度的测定。结果:（1）成功构建了pGEM-T/sVP1,测序和酶切鉴定证明符合预期结果。（2）成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1,酶切分析证明符合预期设计。（3）成功构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1,用PacⅠ酶切得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的片段,PCR鉴定目的基因长度与预期值相符。（4）转染293细胞48小时后,荧光显微镜下观察到报告基因GFP的表达,重组腺病毒Ad/sVP1包装成功。初代病毒再次感染293细胞,在荧光显微镜下观察到逐日明显的细胞病变和荧光聚集,各代病毒感染细胞后均有彗星样荧光斑块形成。（5）重组腺病毒Ad/sVP1感染293细胞48小时后,经Western Blot检测,在细胞培养液中检测到VP1蛋白。（6）重组腺病毒Ad/vp1、Ad/sVP1大量扩增后的病毒滴度依次为: 3.0×109 pfu/ml、5.0×108 pfu/ml。（7）各次免疫后血清CVB3 VP1特异性IgG水平分别为:Ad/VP1组: 1:56.10,1:168.27;Ad/sVP1组: 1:66.68,1:503.50;而PBS组未检测到。单因素方差分析表明,Ad/VP1和Ad/sVP1组VP1特异性IgG逐次增加（P<0.01）;末次免疫后二组比较,Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组（P<0.01）。（8）各次免疫后血清CVB3中和抗体水平分别为:Ad/VP1组:1:8.41,1:31.77;Ad/sVP1组:1:8.91,1:44.87;PBS组未检测到。单因素方差分析表明Ad/VP1和Ad/sVP1组中和抗体水平逐次增加（P<0.01）;第2次免疫后Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组（P<0.05）。（9）小鼠脾淋巴细胞增殖增殖活性经单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,各组间比较无统计学意义;以ConA刺激时, Ad/sVP1组高于其他二组（P<0.05）。（10）小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,Ad/sVP1组与Ad/VP1组杀伤率无统计学意义,但二者均高于PBS对照组（P<0.05）。（11）用3LD50 CVB3攻击小鼠后第7d,血清病毒滴度测定结果表明,Ad/sVP1和Ad/VP1组明显低于PBS组（P<0.05）,且Ad/sVP1组较Ad/VP1组显著降低（P<0.05）。（12）4LD50 CVB3感染小鼠后21d,Ad/sVP1组和Ad/VP1组生存率分别为:58.33% ,41.67%,PBS组无存活。经过χ2检验分析,尚不能确定三组之间有统计学差异。用Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率曲线分布有差异,Ad/sVP1组生存状况好于PBS组（p<0.01）,但与Ad/VP1组比较无统计学意义。结论:（1）本研究利用AdEasy腺病毒载体系统成功包装了重组腺病毒载体疫苗Ad/sVP1,在293细胞内可以表达并分泌至细胞外。（2）Ad/VP1和Ad/sVP1均能诱导小鼠产生中和抗体和特异性IgG抗体,增强脾淋巴细胞增殖活性,降低病毒攻击后血清病毒滴度,提高小鼠的生存率。（3）与Ad/VP1比较,分泌型重组腺病毒Ad/sVP1能更有效的提高体液和脾淋巴细胞增殖活性,降低病毒攻击后的小鼠血中病毒滴度,免疫效果优于Ad/VP1。