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心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤,是指心肌组织缺血后血流重新恢复,组织的损伤程度较缺血时进一步加重、器官功能进一步恶化的现象。钙拮抗剂通过阻断钙离子通道,抑制细胞外 Ca2+内流,拮抗钙超载从而保护心肌损伤。研究表明,钙拮抗剂除了阻断L-型电压依赖性钙离子通道(L-type voltage dependent calcium channel, L-VDCC)发挥抗心肌I/R损伤的效应之外,其心肌保护效应还可能存在非L-VDCC依赖机制。本课题组前期研究表明,临床常用钙拮抗剂维拉帕米(verapamil,Ver)、硝苯地平(nifedipine,Nif)与碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide,F2,我实验室合成的新型结构钙拮抗剂,图1)在心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型上,可通过非L-VDCC途径拮抗心肌细胞H/R损伤。 目的: 探讨钙拮抗剂不影响钙通道阻断所致血液动力学变化的剂量,对心肌 I/R损伤和 MIF表达的影响。在此基础上,进一步在无钙液培养的H9c2心肌细胞上观察钙拮抗剂对H/R损伤的影响,确认钙拮抗剂的非L-VDCC依赖机制。 方法: ⑴将雄性SD大鼠随机分组如下进行 MIF时效关系实验:假手术组(Sham);缺血5 min组(I5min);缺血15 min组(I15min);缺血30 min组(I30min);缺血45 min组(I45min);缺血60 min组(I60min);缺血45 min再灌注0.5h组(I45min/R0.5h);缺血45 min再灌注1h组(I45min/R1h);缺血45 min再灌注2h组(I45min/R2h);缺血45 min再灌注3h组(I45min/R3h);缺血45 min再灌注4h组(I45min/R4h);缺血45 min再灌注6h组(I45min/R6h)。⑵将雄性SD大鼠随机分组如下进行药效关系实验:假手术组(Sham);模型组(I45min/R3h);溶剂组(DMSO);模型+钙拮抗剂组(F2(1.5 mg/kg)、Ver(0.75 mg/kg)、Nif(0.2 mg/kg)和Dil(0.5 mg/kg))。⑶Western-blot检测心肌组织Cleaved caspase-3的表达。⑷TUNEL检测心肌组织细胞晚期凋亡。⑸ELISA检测心肌组织炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。⑹Western-blot和免疫组织化学法检测心肌组织MIF蛋白的表达。⑺ELISA检测血清MIF的含量。⑻将H9c2心肌细胞随机分组如下进行Cleaved caspase-3时效实验:正常组(Ctrl);缺氧0.5h组(H0.5h);缺氧1h组(H1h);缺氧2h组(H2h);缺氧3h组(H3h);缺氧1h复氧0.5h组(H1h/R0.5h);缺氧1h复氧1h组(H1h/R1h);缺氧1h复氧2h组(H1h/R2h);缺氧1h复氧3h组(H1h/R3h);缺氧1h复氧4h组(H1h/R4h)。⑼将H9c2心肌细胞随机分组如下进行药效实验:正常组(Ctrl);无钙组(0Ca2+2h);无钙+钙拮抗剂组(0Ca2+2h+钙拮抗剂);模型组(H1h/R1h);溶剂组(DMSO);模型+钙拮抗剂组(钙拮抗剂)。⑽Western-blot检测Cleaved casepase-3的表达。⑾Annexin V-FITC/PI检测细胞早晚期凋亡。⑿TUNEL检测细胞晚期凋亡。⒀ELISA检测细胞上清液炎症因子IL-6和IL-1β的含量。 结果: ①与Sham组相比,大鼠心肌缺血45 min再灌注3 h(I45min/R3h)引起心肌Cleaved caspase-3表达增加、凋亡细胞增加、炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量增加。②与I45min/R3h组相比,F2(1.5 mg/kg)能减少大鼠心肌I/R心肌 Cleaved caspase-3表达,减轻细胞凋亡。③与I45min/R3h组相比,F2(1.5 mg/kg)能减少大鼠心肌I/R炎症因子TNF-α表达, F2(1.5 mg/kg)、Ver(0.75 mg/kg)能减少大鼠心肌I/R IL-6的表达,F2(1.5 mg/kg)、Ver(0.75 mg/kg)和Nif(0.2 mg/kg)能减少大鼠心肌I/R IL-1β的表达。④与Sham组相比,大鼠心肌I45min/R3h引起心肌组织MIF蛋白和mRNA表达减少,血清MIF含量增加。与I45min/R3h组相比,F2(1.5 mg/kg)、Ver(0.75 mg/kg)和Nif(0.2 mg/kg)能上调大鼠心肌I/R MIF蛋白表达,F2(1.5 mg/kg)和Nif(0.2 mg/kg)能减少大鼠心肌I/R血清MIF的含量。⑤与Ctrl组相比,H9c2心肌细胞在无钙培养基中培养2 h引起Cleaved caspase-3的表达增加,但是钙拮抗剂不能减少Cleaved caspase-3的表达。与Ctrl组相比,无钙液培养H9c2心肌细胞缺氧1h/复氧1h(H1h/R1h)Cleaved caspase-3增加,Annexin V-FITC/PI检测的早晚期凋亡细胞率增加,TUNEL检测的晚期凋亡细胞率增加,ELISA检测的细胞上清液中IL-6和IL-1β的含量增加。⑥与H1h/R1h组相比,Ver、Nif和F2能显著减少无钙液培养H9c2心肌细胞H/R Cleaved caspase-3的表达,Ver、Nif和F2能剂量依赖地减少无钙液培养 H9c2心肌细胞H/R早晚期凋亡细胞率。⑦与H1h/R1h组相比,Ver、Nif和 F2能剂量依赖地减少无钙液培养 H9c2心肌细胞H/R IL-6和IL-1β的释放。 结论: 阈下剂量钙拮抗剂Ver、Nif和F2可以拮抗大鼠心肌I/R损伤,并能拮抗无钙液培养H9c2心肌细胞H/R损伤。提示钙拮抗剂可以通过非L-VDCC途径拮抗心肌I/R损伤,其作用机制与调控MIF的异常表达有关。