论文部分内容阅读
目的： 根据前期发现的大肠杆菌ATCC25922经庆大霉素处理后表型的变化，结合转录组测序结果，筛选差异基因，探讨大肠杆菌在体外经亚抑制浓度的庆大霉素短期预处理后，运动性被抑制的分子机制。观察细菌再次接触庆大霉素后发生适应性耐药的现象，构建yhjX基因的敲除株和互补株，以期揭示大肠杆菌对庆大霉素发生适应性耐药的相关分子机制。 方法： ⑴微量肉汤稀释法测庆大霉素对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）。⑵1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC庆大霉素对大肠杆菌预处理1小时后测生长曲线。⑶1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC庆大霉素对大肠杆菌预处理1小时后在半固体培养基上测定其游动运动和涌动运动。⑷转录组测序比较表达水平的差异，用Real-time PCR对基因sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、motA、motB、filF、fliG、fliM、fliN、yhjX进行验证。⑸ELISA试剂盒测大肠杆菌菌体内琥珀酸脱氢酶的浓度。⑹酶标仪法测大肠杆菌菌体内延胡索酸的浓度。⑺在涌动琼脂平板里各添加0.9 mM、1.8 mM、3.6 mM的延胡索酸溶液和1 mM、2 mM、4 mM的丙二酸溶液，经亚抑制浓度的庆大霉素对大肠杆菌预处理1小时后测涌动运动。⑻微量肉汤稀释法测庆大霉素对大肠杆菌的野生菌株、敲除菌株和互补菌株的MIC。⑼大肠杆菌的野生菌株、敲除菌株和互补菌株在含1 MIC和1/2 MIC庆大霉素的MH肉汤里测生长曲线。⑽经亚抑制浓度的庆大霉素诱导大肠杆菌的野生菌株、敲除菌株和互补菌株1小时后，再接触1 MIC和1/2 MIC庆大霉素，测生长曲线和平板菌落计数。 结果： ①大肠杆菌的MIC为2μg/ml。②大肠杆菌在1/2 MIC庆大霉素与无庆大霉素预处理后生长曲线基本一致。③与对照组相比，1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC庆大霉素预处理能够显著抑制大肠杆菌的涌动运动，且庆大霉素的浓度越大抑制作用越大。然而庆大霉素对大肠杆菌的游动运动无明显作用。④与对照组相比，测序结果显示处理组基因sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、motA、motB、fliG的表达水平下调了，filF、fliM、fliN、yhjX的表达水平上调了。除了基因fliG，其余验证结果与转录组测序结果基本一致。⑤处理组的琥珀酸脱氢酶浓度比对照组显著下降。⑥处理组的延胡索酸浓度比对照组显著下降。⑦延胡索酸可以逆转由庆大霉素引起抑制的涌动运动，且延胡索酸的浓度越高逆转的程度越大。而丙二酸可以加强由庆大霉素引起的涌动运动抑制作用。⑧大肠杆菌的的野生菌株、敲除菌株和互补菌株的MIC均为2μg/ml。⑨在1/2 MIC庆大霉素中，敲除菌株明显比野生菌株和互补菌株的生长情况好。⑩在1/2 MIC庆大霉素中，野生和互补菌株会出现适应性耐药，而敲除菌株不会出现适应性耐药。 结论： ⑴亚抑制浓度的庆大霉素预处理可抑制大肠杆菌的涌动运动，该作用可以认为是庆大霉素的特殊抗生素后效应之一。这种抑制作用是由琥珀酸脱氢酶sdh基因表达水平下调，继而使大肠杆菌延胡索酸生成减少引起的。⑵大肠杆菌在亚抑制浓度的庆大霉素诱导后可以发生适应性耐药。适应性耐药的发生可能与yhjX基因高表达有关，同时基因yhjX有可能在应激环境下，参与调控细菌的生长及代谢。