背景：皮肤创面修复是创伤治疗学中的重要环节,创面愈合是多种细胞和细胞因子共同参与的复杂过程,其中一个基本条件是创面的再上皮化(re-epithelization),即表皮细胞从创缘或残留的表皮细胞岛向创面中心增殖分化以覆盖创面而完成修复过程。皮肤再上皮化的过程中,人表皮干细胞(human Epidermal Stem Cells, hESCs)担任着十分重要的角色。表皮干细胞是皮肤组织的特异性干细胞,来源于胚胎的外胚层,有较原始的分化能力,具有非成熟细胞的特征,即细胞体积小、细胞器少、处于静止状态,主要位于皮肤的基底细胞层以及毛囊外根鞘隆突部。表皮干细胞因为具有自我更新和强大的增殖潜能,故被认为是皮肤组织工程理想的种子细胞。表皮干细胞是各种表皮细胞的祖细胞,具有双向分化的能力。可向下迁移分化形成表皮基底层,进而形成毛囊,又能向上分化为表皮细胞,对皮肤损伤修复及毛囊的生长起关键作用。近年来,关于成体干细胞功能受生长因子、激素和神经递质等因素调节的研究已得到大家的广泛认同,而神经肽对各种干细胞的调控作用已成为近来研究的重点。阿片肽属于神经肽类一种,其与受体广泛存在于人体各组织器官,介导多条信号通路的传导,并调节诸多生理功能。已被提出的体内阿片受体共有μ、K、δ、σ、ε5种,但较为公认的有3种,即u型受体(mu-opioid receptor, MOR)、K型受体(kappa-opioid receptor, KOR)和δ型受体(delta-opioid receptor, DOR)。目前有研究显示,三种阿片受体在表皮干细胞上均有表达,并参与组织的愈合、角质形成细胞的增殖和分化。当皮肤遭受创伤后,角质形成细胞强表达阿片受体而且产生各种细胞因子。MOR的配体β-内啡呔(beta-endorphin)刺激角质形成细胞的迁移活动,但是KOR的配体强啡肽(Dynorphin)在同样的条件下只有极小的作用。阿片肽受体的拮抗剂纳络酮(naltrexone)能明显减少β-内啡呔对角质形成细胞的迁移作用。总之,无论是离体实验,还是在体情况下,均有证据表明,阿片肽调节角质形成细胞的分化参与创面的再上皮化过程。近年来的研究发现,正常大鼠皮肤组织内β-内啡肽和u型阿片受体主要分布于真、表皮交界的周围神经末梢及部分表皮的角质形成细胞和真皮的成纤维细胞中。皮肤组织烧伤即刻β-内啡肽的表达增多,随后μ型阿片受体的表达增强,至创面完全愈合,β-内啡肽的表达恢复正常水平,但u型阿片受体仍有表达。说明烧伤愈合过程中β-内啡肽和μ型阿片受体的表达具有一定的时空特性,是参与影响创面愈合的因素之一。但是到目前为止,阿片肽及其受体系统在皮肤组织的代谢和创面愈合中的具体作用机制及其在表皮干细胞的增殖、迁移与分化中的作用尚不明确。目的：1、分离培养人表皮干细胞(epidermal stem cells, ESCs)并对其进行鉴定,了解其体外正常生长情况,为表皮干细胞的相关研究储备种子细胞。2、观察三种阿片受体mu型(μ-opioid receptor, MOR)、kappa型(κ-opioid receptor, KOR)和delta型(δ-opioid receptor, DOR)的活化和抑制对体外培养的人表皮干细胞增殖与迁移能力的影响。方法：1、人表皮干细胞的分离、培养与鉴定。取自愿捐赠的新鲜青年包皮标本,去除皮下组织,PBS洗3次,加入0.25%Dispase II5ml于4℃过夜；分离并剪碎表皮,置于含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶中消化10min,加入含10%FBS的培养基终止消化,吹打成单细胞悬液,200目滤网过滤。1000r/min,离心5min,弃上清,加入表皮干细胞培养基(K-SFM,30μg/ml BPE,5ng/ml hEGF)重悬细胞,接种至预先用Ⅳ型胶原蛋白包被的培养瓶中,静置l0min,显微镜下观察部分细胞已贴壁,吸出全部培养基及未贴壁细胞,加入新鲜培养基,于37℃、5%C02孵箱培养,隔日换液。收集第2代细胞,制作细胞爬片,4%多聚甲醛固定和洗涤后分别加入鼠抗人整合素β1以及鼠抗人CK19单克隆抗体,37℃孵育1h,加入FITC标记的兔抗鼠IgG(1：50)及Cy3标记的兔抗鼠IgG(1：50),37℃孵育1h,PBS洗去二抗,免疫荧光显微镜下观察并拍照。制作流失细胞样本,免疫荧光染色后,流式细胞仪检测细胞纯度。2.阿片受体激动剂及抑制剂对hESCs增殖活性的影响：取分离培养的第2代hESCs,消化重悬后,按4×103/孔密度接种于用Ⅳ型胶原蛋白包被的96孔培养板板中。本实验共设7个实验组,分为3批。第一批：探讨u型阿片受体激活或抑制对人表皮干细胞的增殖活性的影响：μ型阿片受体激动剂组(A1组)加入含lnmol/LEndorphin的K-SFM培养基,u型阿片受体阻断剂组(A2组)加入含10nmol/LNaltrexone和lnmol／LEndorphin的K-SFM培养基,空白对照组(D组)加入单纯的K-SFM培养基进行培养。第二批：探讨δ型阿片受体激活或抑制对人表皮干细胞的增殖活性的影响：δ型阿片受体激动剂组(B1组)加入含lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培养基、δ型阿片受体阻断剂组(B2组)加入含lnmol/L Naltrindole和lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培养基、空白对照组(D组)加入单纯的K-SFM培养基进行培养。第三批：探讨K型阿片受体激活或抑制对人表皮干细胞的增殖活性的影响：K型阿片受体激动剂组(C1组)加入含2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培养基,K型阿片受体阻断剂组(C2组)加入含5nmol几5’Guanidinonaltrindoledi和2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培养基,空白对照组(D组)加入单纯的K-SFM培养基进行培养。由加药后开始算起,每24h各组取10个复孔做增殖情况测定。在待测定的细胞板孔中加入5mg/ml的MTT溶液,按20ul/孔加入,然后放置在培养箱里培养4h,取出细胞,吸干培养基及MTT溶液,于每孔内加入150ul的DMSO,常温震荡l0min,酶标仪测定各孔吸光度值。连续测量5天,记录各组每天的吸光度值,并绘制细胞生长曲线。3.阿片受体激动剂及抑制剂对hESC迁移活性的影响：将消化好的hESCs接种于Ⅳ型胶原蛋白包被的6孔培养板中,各组正常培养至细胞铺满板底后,移至超净工作台中用灭菌200μl移液枪头在培养板底部刮擦生长融合成片的单层细胞,制备宽度约为100μm的体外单层hESCs缺损模型。PBS洗去脱落细胞,更换培养基。将制作的单层细胞缺损模型分为7组,每组6个复孔,具体实验分组同上。按确定的分组方案加入含实验药物的K-SFM培养基。显微镜下观察并拍照并记录划痕宽度。此后每24h观察细胞向缺损区域增殖、迁移情况,拍照记录,共观察96h。对拍摄的照片,采用Image-Pro Plus软件按以下公式计算创面愈合率：创面愈合率=迁移至创面的细胞所占面积/创面原始面积×100%。结果：1、人表皮干细胞分离培养结果及鉴定：分离培养的原代表皮干细胞呈单个或集落样生长,3d后可见贴壁细胞出现克隆样生长,7d后可见细胞呈鹅卵石样铺于瓶底,9-10d后见80%细胞融合,可进行传代。取第2代人表皮干细胞经免疫荧光染色鉴定,可见整合素β1、CK19呈阳性标记,提示分离培养的细胞为表皮干细胞。所有经过流失细胞仪的细胞中,整合素β1阳性染色的细胞所占比例为(95.6±0.76)%,CK19染色阳性的细胞所占比例为(93.7±0.81)%,提示分离培养的细胞主要为人表皮干细胞,且细胞纯度较高。2、三种阿片受体激动剂及抑制剂对表皮干细胞分裂增殖活性的影响：经MTT法测定各组连续5d的吸光度值,可见MOR、DOR的激活都可促进人表皮干细胞的增殖,而阻断该受体,则表皮干细胞的增殖活性受到抑制。KOR受体对表皮干细胞的增殖活性无明显影响,实验数据显示：无论激活还是阻断KOR,表皮干细胞的增殖能力都不受影响。3、阿片受体激动剂及抑制剂对表皮干细胞体外迁移活性的影响：表皮干细胞体外单层细胞缺损模型制备后24h,倒置相差显微镜下即可见各组均有表皮干细胞向创缘方向迁移,但MOR激动剂组越过创缘的细胞数多于对照组,MOR阻断剂组少于对照组。DOR激动剂组越过创缘的细胞数多于对照组,DOR阻断剂组少于对照组。而KOR激动剂组、KOR阻断剂组与对照组比较,均无明显差异。模型制备后72h,各组创面愈合率分别为,D组：81.05±0.56%,A1组：89.46±0.73%,A2组：76.10±0.32%,A1组明显高于D组,A2组低于D组,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)；B1组：85.79±0.49%,B2组：77.23±0.54,B1组明显高于D组,B2组低于D组,各组间差异有统计学意义(P<0.05)；C1组：81.65±0.35%,C2组：80.14±0.71%,与对照组比较,三组间差异均无统计学意义(P>0.05)。模型制备后96h,各组创面基本完全愈合,各组间无对比意义。结论：1、本实验采用中性蛋白酶联合胰蛋白酶消化法分离表皮细胞,用Ⅳ型胶原蛋白快速贴壁法从皮肤细胞中分选得到纯度较高的人表皮干细胞,用无血清培养基K-SFM培养细胞,见细胞生长情况良好。采用免疫荧光染色法检测细胞表面K19和整合素β1的阳性表达情况,来鉴定表皮干细胞,初步认为本实验所培养的细胞为人表皮干细胞。2、通过用三种阿片受体激动剂及阻断剂来刺激人表皮干细胞,发现μ型阿片受体活化后可促进人表皮干细胞的分裂增殖和迁移活动,而该受体被特异性阻断剂阻断后,则抑制细胞的增殖和迁移；δ型阿片受体活化后也对表皮干细胞的增殖和迁移活动有促进作用,该受体被阻断后可抑制表皮干细胞的增殖和迁移；但K型阿片受体无论被激活还是被阻断,都对人表皮干细胞的增殖和迁移无明显影响作用。