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小儿病毒性肺炎是儿科临床最常见的感染性疾病之一,严重危害着小儿的健康。我国卫生部将小儿肺炎列为重点防治的四种儿科疾病之一。病毒性肺炎大约占到小儿肺炎的—半左右,而呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是小儿病毒性肺炎的重要病原体之一。在婴幼儿的病毒性肺炎中,RSV肺炎较为常见。目前,现代西医学尚无特效的抗RSV病毒药,也无安全有效的RSV疫苗。中药在抗病毒感染性疾病治疗中有独特优势,临床研究及实验研究证明金欣口服液是抗RSV感染的有效中药。TLRs作为I型跨膜受体,可识别不同微生物的病原分子相关模式。而RSV为单链RNA病毒,其进入机体内后,内部所含的单链RNA(ssRNA)外露,可以识别病毒ssRNA的TLR7就可能发挥重要作用。本研究从TLR7信号转导通路入手,通过研究临床治疗RSV肺炎的有效方金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α的调控作用,研究金欣口服液抗RSV感染的机制。目的通过研究金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α的调控作用,研究金欣口服液抗RSV感染的机制。方法本实验采用Realtime RT-PCR、Western blot、ELSIA法检测RSV感染后RAW264.7细胞和BALB/c小鼠的TLR7、IRF7、IFN-α的表达水平。Realtime RT-PCR数据采用相对定量法计算,其余数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理。结果1.体外实验(1)RSV感染RAW264.7细胞24h后,TLR7mRNA表达水平与正常细胞组相比,显著升高(P<0.05)；利巴韦林组和金欣含药血清组TLR7mRNA表达水平均为正常细胞组的0.5倍以下,有显著性差异(P<0.05),与RSV感染组相比TLR7mRNA表达量降低(P<0.05),其中金欣含药血清的下调作用较利巴韦林更为明显。IRF7mRNA表达量为正常细胞组的3.12倍,明显增高并具有显著性差异(P<0.05),利巴韦林和金欣含药血清均可以显著下调RSV感染的RAW264.7细胞的IRF7mRNA表达(P<0.05),金欣含药血清的下调作用与利巴韦林相比,未见明显差异。(2)RSV感染RAW264.7细胞24h后TLR7蛋白表达较正常组增加,而金欣含药血清可显著下调TLR7蛋白表达(P<0.01)；IRF7表达量较正常组相比升高(P<0.05),而金欣含药血清组的IRF7表达量较RSV组稍高,但无明显统计学意义(P>0.05)。(3)RSV感染RAW264.7细胞24h后取细胞上清,测得IFN-a的含量极低。2.体内试验(1)在RSV感染BALB/c小鼠24h后,TLR7mRNA表达量较正常组有升高趋势(P>0.05),而金欣高、低剂量预防给药及利巴韦林有降低TLR7mRNA表达的趋势(P>0.05),其中以金欣低预防组最为明显：RSV感染BALB/c小鼠72h后,TLR7mRNA的表达较24h时有所下降,而金欣组和利巴韦林组均较24h时明显增多,其中尤其以金欣低剂量治疗组上调作用最为明显；在RSV感染BALB/c小鼠144h后,TLR7mRNA的表达较72h时进一步下降,利巴韦林组和金欣口服液组较144h TLR7mRNA的表达下降,但与RSV感染组相比,利巴韦林组和金欣高治疗组均可上调TLR7mRNA的表达(P<0.05),尤以金欣高治疗组的上调作用最为明显。(2)在RSV感染BALB/c小鼠24h后,IRF7mRNA表达水平较正常组显著增高(P<0.01),而金欣口服液预防给药组及利巴韦林组IRF7mRNA的表达较RSV感染组明显降低(P<0.05),其中以金欣口服液低预防给药组的下调作用最为明显；随着感染时间延长RSV感染组IRF7mRNA逐渐下降,而金欣组和利巴韦林组的IRF7mRNA的表达上升并超过RSV感染组,其中金欣高治疗组IRF7mRNA的表达高于利巴韦林组(P<0.05)。(3)RSV感染BALB/c小鼠后TLR7的表达量下降(P<0.05),而金欣口服液组对TLR7下调作用较RSV感染组更为显著(P<0.05)。在感染初期BALB/c小鼠IRF7的表达量下降,而金欣口服液干预后,对IRF7表达量的下调更为明显,在感染晚期,金欣口服液高剂量治疗组与RSV感染组相比,可以提高IRF7的蛋白表达量(P<0.05)。(4)本研究体内实验表明在RSV感染小鼠早期IFN-α表达量升高(P<0.05),金欣口服液低预防组及高预防组能明显提高IFN-α表达量,随感染时间延长IFN-α表达量较前下降,金欣口服液高、低治疗组均能明显提高IFN-α的表达(P<0.05),持续起到抗病毒效应。病毒感染性疾病后期IFN-α均较前进一步下降,金欣口服液组IFN-α表达量较RSV感染组低(P<0.05)。结论1.金欣口服能够从核酸转录和蛋白质合成层面调控TLR7和IRF7的表达。2.金欣口服液对RSV感染RAW264.7细胞TLR7和IRF7的mRNA有下调作用,对TLR7蛋白有下调作用,对IRF7蛋白表达调控作用不显著。3.金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠的TLR7和IRF7的mRNA表达量以及IRF7的蛋白表达量,在感染早期能够下调其表达,在感染后期能够上调其表达;对TLR7的蛋白表达量有下调作用。4.金欣口服液对RSV感染BALB/c小、鼠的IFN-α表达量的影响,在感染早期能够上调其表达,在感染后期能够下调其表达。5.金欣口服液是抗RSV感染的有效药物,其作用机制可能与调节TLR7信号转导通路上的TLR7、IRF7、IFN-α的表达量有关。