NADPH氧化酶3源性活性氧在游离脂肪酸诱导的肝脏胰岛素抵抗发生中的作用机理研究

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2型糖尿病的病理生理特点是胰岛素分泌不足或利用障碍,除血糖升高(Hyperglycemia)外,脂代谢紊乱也是糖尿病伴随的特征之一。游离脂肪酸(Free fatty acids, FFA)是联系脂代谢紊乱和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的重要环节。肥胖引发的FFA水平升高可通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢,在胰岛素抵抗的病理过程中占有重要的地位。肝脏是胰岛素的重要靶器官之一,肝脏的胰岛素抵抗在2型糖尿病发生发展过程中发挥着重要作用。研究已表明,高FFA诱发的氧化应激是导致肝脏胰岛素抵抗的重要原因。氧化应激(Oxidative stress)是指机体在遭受各种有害刺激时体内高活性分子如活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species, RNS)的产生过多,氧化程度超出抗氧化系统对氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。机体内有多种酶体参与了ROS的生成,如NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)、黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)、线粒体呼吸链酶复合体、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS)及脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)等,一些研究认为NOX是肝脏内生成ROS的主要酶体。最早在吞噬细胞中发现的NOX是由多个亚基组成的酶复合体,包括胞膜组分:细胞色素b558(gp91PHOX和p22PHOX)和胞浆组分:p47PHOX、p67PHOX及Rac(小的GTP结合蛋白)共五个亚组分。gp91PHOX(有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点)和p22PHOX是NOX的酶促核心,它们受p47PHOX及Rac的调节。近几年已发现NOX的同源家族有NOX1、NOX2 (gp91PHOX)、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1(Dual oxidase 1)和Duox2等成员。研究显示肝脏细胞主要表达NOX3。虽然实验研究已证实FFA在胰岛素抵抗发生过程中起着重要的作用,但其作用的分子机理尚不清楚,还有待阐明。本研究旨在探讨NOX3源性ROS在FFA诱导的肝脏胰岛素抵抗发生中的作用机理。首先我们用不同浓度(0.15-0.35mmol/L) Palmitate(棕榈酸)处理人肝脏细胞HepG2,通过DCFH-DA荧光染色结合流式细胞术检测ROS水平的改变。结果显示,与正常培养条件相比,Palmitate导致HepG2细胞中ROS水平的显著升高,其作用具有浓度和时间依赖性。分别用产生ROS途径的抑制剂如NOX抑制剂DPI (Diphenyleneiodoniumcloride)、线粒体呼吸链酶复合体抑制剂Rotenone、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和黄嘌呤氧化酶抑制剂Oxypurinol预处理后的结果显示,DPI和Rotenone处理组的ROS水平显著降低,其中DPI降低ROS水平的作用最为显著,而其他抑制剂处理组的ROS水平无明显变化。提示NOX是高FFA诱导HepG2细胞产生ROS的主要来源。进一步应用Western blot分析NOX亚组分的表达变化。结果表明,HepG2表达NOX3、p22PHOX、p47PHOX和Rac-1。NOX3和p47 PHOX的表达在0.25mmol/L Palmitate处理后显著升高,p22PHOX和Rac-1则无显著性改变。观察Palmitate对NOX3活性的调节机理的结果表明,在0.25mmol/L Palmitate作用下,HepG2细胞的NOX3活性主要是通过p47PHOX的膜移位来调节。用检测细胞内糖原合成和培养上清中葡萄糖的含量来观察细胞的胰岛素抵抗。结果显示,Palmitate处理后HepG2细胞内糖原合成量显著降低,细胞培养上清中葡萄糖的浓度显著升高,提示Palmitate诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗。为了确定NOX3源性ROS在HepG2产生胰岛素抵抗中的作用,我们采取“失去功能”的策略,将NOX3-siRNA转染入HepG2细胞,获得低表达NOX3水平的HepG2细胞。分析比较这些HepG2细胞和对照HepG2细胞(未转入NOX3-siRNA)中ROS水平与胰岛素抵抗状态。经NOX3-siRNA转染抑制NOX3表达后,Palmitate所引起的ROS升高和胰岛素抵抗均受到抑制。说明NOX3参与了FFA引起的ROS的生成和胰岛素抵抗。在此基础上,我们进一步探讨FFA诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗的机理。结果显示,0.25mmol/L Palmitate处理HepG2细胞后,伴随NOX3表达与ROS水平的升高,磷酸化的p38MAPK、PTEN、JNK、IRS1增多,胰岛素信号通路中的AKT、GSK、FOXO1的磷酸化水平下降。表明FFA通过NOX3介导的氧化应激诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗,其机理涉及到p38MAPK/PTEN、JNK和PI-3K/AKT信号通路。我们用db/db小鼠作为胰岛素抵抗模型进一步证实NOX3源性ROS在FFA诱导的肝脏胰岛素抵抗发生中的作用机理。油红O染色结果显示db/db小鼠肝脏中脂肪堆积。与正常对照小鼠相比,db/db小鼠血清中FFA、GLU浓度显著升高。以血清中的MDA水平、肝脏中ROS生成和NOX3表达作为评价氧化应激的指标,结果表明,db/db小鼠MDA水平显著升高,肝脏中NOX3表达增强,ROS生成增多。此外,db/db小鼠血清胰岛素和糖化血红蛋白水平明显高于正常对照小鼠,提示db/db小鼠发生了胰岛素抵抗。用检测肝组织中糖原含量进一步分析db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗状况,结果显示db/db小鼠肝脏糖原含量显著低于正常对照小鼠,表明db/db小鼠肝脏处于胰岛素抵抗状态。与体外结果相一致,p38MAPK/PTEN、JNK和PI-3K/AKT信号通路参与了肝脏胰岛素抵抗的发生过程。综上所述,本研究得出以下结论:1、Palmitate主要通过上调NOX3的表达和活性显著提高HepG2细胞中的ROS水平;2、Palmitate通过引起p47PHOX膜移位促进NOX3的活化;3、高浓度Palmitate可诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗,而干扰NOX3的表达可以抑制Palmitate引起的胰岛素抵抗;4、db/db小鼠血清FFA水平显著升高,肝脏中脂肪堆积,引起NOX3介导的氧化应激,导致了胰岛素抵抗的发生;5、体内与体外的结果均表明,p38MAPK/PTEN、JNK和PI-3K/AKT信号通路参与了FFA诱导的胰岛素抵抗。本研究从NOX3介导的氧化应激的新角度阐明FFA诱导胰岛素抵抗的发生机制,为胰岛素抵抗和糖尿病的防治提供了新的思路。
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