研究背景随着社会老龄化程度的加剧、生活方式的变革及环境污染的加重,中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病的发病率也逐年攀升。据相关数据推测,到2050年,全球患有老年痴呆的人数将从目前的4600万人增加至1.315亿人。脑胶质瘤是当前全球最常见的十大肿瘤之一,其发病率于2000年至2011年间在我国呈显著增长趋势（年度增长率2.1%）。此外,其他CNS疾病如脑卒中、脑膜炎、亨廷顿舞蹈症、癫痫和心理疾病也造成巨大的社会和经济负担。尽管生物医学理论和技术的发展使我们对CNS疾病的病理生理学机制的有了更好的了解,然而CNS疾病的药物临床试验通过率低仍然是困扰药物研发工作者的巨大难题。近年来开发的CNS疾病药物数量很多,有些药物即使在开发的早期阶段取得了良好的效果,大部分也无法成功地通过随后的临床试验,部分原因是它们无法透过血脑屏障（blood brain barrier,BBB）。2014年全球顶级处方药统计数据显示,在排名前十的药物中,只有一种是CNS疾病药物;此外,在全球销售额排名前十的治疗领域中,只有两个是CNS治疗领域,这两个都是疼痛和精神健康相关的产品。从这些数据来看,CNS疾病药物治疗研究进展不尽如人意,其主要原因是药物无法通过BBB^[1]。为增加药物向CNS递送,近年来研究的方法包括纳米技术、药物修饰、聚焦超声联合微泡等^[2]。上述方法存在成本昂贵、副作用大或作用轻微等缺点,安全可控地促进BBB开放仍是目前研究者关注的焦点。本实验室前期研究结果发现特定条件下电磁辐射（Electromagnetic radiation,EMR）能够增加BBB的通透性。如场强200 kV/m、脉冲次数为200次的电磁脉冲（Electromagnetic pulse,EMP）能够暂时性开放BBB,且不引起热效应。但是EMP的哪些物理参数能达到最佳的BBB开放效果?以及EMP致BBB开放的具体分子学机制如何?其他的脉冲EMR是否也会导致BBB的开放?这些问题尚不清楚。因此,本研究以SD大鼠为研究对象,探讨了不同参数EMP和不同磁场强度脉冲磁辐射（Pusled magnetic field,PMF）,对大鼠BBB通透性的影响及BBB相关蛋白的作用,从而为CNS疾病药物治疗新策略的开发提供数据支持。第一部分不同参数EMP对BBB通透性的影响目的:以Sprague Dawley大鼠为研究对象,探讨不同参数EMP辐照对BBB通透性的影响,筛选EMP致BBB开放的最佳物理参数,同时对EMP致BBB开放的可能分子学机制进行初步探讨。为下一步的医学应用研究提供实验依据。方法:用内源性白蛋白免疫组织化学法和外源性伊文斯兰（Evans blue,EB）示踪法评价不同参数EMP辐照后的BBB开放情况。1.不同场强EMP对BBB通透性的影响:48只SD大鼠随机分成假辐照（sham）组、三个不同场强组（350 kV/m、480 kV/m、720 kV/m）,每组12只。6只用于白蛋白免疫组织化学,6只用于EB的荧光切片。EMP其他参数为脉冲次数800次,脉宽40 ns,上升前沿19 ns,重复频率1 pps。大鼠在辐照仓内全身辐照,头部朝向脉冲源方向,辐照后3 h取材。2.不同脉冲次数EMP对BBB通透性的影响:48只SD大鼠随机分成sham组、三个不同脉冲次数组（200次、400次、800次）,每组12只。6只用于白蛋白免疫组织化学,6只用于EB的荧光切片。EMP其他参数为场强720 kV/m,脉宽40 ns,上升前沿19 ns,重复频率1 pps。大鼠辐照后3 h取材。3.不同重复频率EMP对BBB通透性的影响:48只SD大鼠随机分成sham组、三个不同的重复频率组（1 pps、10 pps、20 pps）,每组12只。6只用于白蛋白免疫组织化学,6只用于EB的荧光切片。EMP其他参数为场强720 kV/m,脉宽40 ns,上升前沿19 ns,脉冲次数800次。大鼠辐照后3 h取材。4.EMP辐照后紧密连接（Tight junction,TJ）超微结构的变化:用透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察EMP作用后大鼠BBB的TJ超微结构变化。5.不同参数EMP辐照后BBB通透性相关蛋白表达水平变化:不同脉冲次数（200次、400次、800次）不同重复频率（1 pps、10 pps）的EMP辐照后,用western blot检测大鼠额叶皮层组织TJs相关蛋白,包括ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白水平变化;陷窝结构蛋白Caveolin-1表达变化;基质金属蛋白酶MMP-9的表达水平。免疫荧光观察Caveolin-1的在脑内的分布情况及不同组别间表达量的差异。结果:免疫组化和EB荧光示踪法结果显示:不同参数EMP辐照后3 h,大鼠脑组织微血管周围的白蛋白和EB渗出明显增加,提示EMP辐照后BBB的通透性增加;并且随着场强、脉冲次数增加而BBB通透性变化越明显。与sham组相比,重复频率为10 pps、20 pps开放效果较好（P<0.05）。TEM结果显示,场强720 kV/m、脉冲次数800次、重复频率10 pps的EMP辐照后3 h,大鼠脑组织额叶皮层微血管内皮细胞间的TJ结构疏松。Western blot结果显示:与sham组相比,不同脉冲次数、不同重复频率EMP辐照后3h的TJ相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白水平显著降低,与sham组相比差异有统计学意义（P<0.05）;EMP辐照组的Caveolin-1和MMP-9的表达水平与sham组相比明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光结果显示Caveolin-1主要表达在脑组织的微血管周围,EMP辐照组的阳性水平明显高于sham组。第二部分不同磁场强度PMF对BBB通透性的影响目的:探讨不同磁场强度PMF对SD大鼠BBB通透性的影响。方法:选取72只SD大鼠,随机分为sham组,阳性对照组和4个不同磁场强度PMF辐照组（100 mT、400 mT、800 mT、1.2 T）,每组12只,辐照组每组脉冲次数30个,磁场频率50 Hz,脉冲间隔1 min。动物辐照后3 h,采用HE染色评价大鼠海马组织形态学结构;免疫组织化学法检测大鼠脑内微血管周围白蛋白渗出情况;外源性EB荧光法观察微血管周围EB渗出情况;Western Blot法检测脉冲磁场辐照后BBB的TJ相关蛋白ZO-1和Occludin的表达变化情况。结果:与sham组相比,不同磁场强度PMF组大鼠海马组织形态学结构无明显变化,脑微血管周围未见白蛋白和EB明显渗出,半定量分析结果显示各辐照组与sham组相比均无统计学差异（P>0.05）。1.2 T辐照组与sham组相比,ZO-1蛋白水平显著降低,差异有统计学差异（P<0.05）,Occludin蛋白水平及其他磁场强度辐照组的ZO-1水平未见明显变化。上述研究结果提示本实验条件下,磁场强度为1.2 T低频PMF辐照对SD大鼠的BBB通透性无明显影响,但是ZO-1蛋白水平的降低提示BBB完整性受到损伤,下一步实验应探讨更高的磁场强度或更大的脉冲次数对完整性的影响。研究结论1.EMP辐照可能增加BBB的通透性,影响EMP增加BBB通透性的物理参数包括场强、脉冲次数和重复频率。增加EMP的场强、脉冲次数,BBB通透性也随之增强。重复频率为10 pps或20 pps时,大鼠BBB通透性变化比重频1 pps组更明显。2.EMP辐照后,大鼠BBB的TJ超微结构破坏,TJ相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5表达水平降低,Caveolin-1和MMP-9表达水平增高,提示这些分子可能参与了EMP致BBB通透性改变的作用机制。3.本实验条件下的PMF辐照对大鼠BBB通透性无明显影响,然而1.2 T磁场强度的PMF可导致TJ相关蛋白ZO-1蛋白水平的降低。