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糖(碳水化合物)是生命体至关重要的生物大分子之一,不仅是生物体不可或缺的结构组分,更承载着许多重要的生物学作用。生物体内,糖以多种形式存在,糖与非糖物质(如肽、蛋白、脂等)结合形成的糖缀合物在肿瘤的发生发展和炎症反应等生理病理过程中发挥重要的作用。疾病的发生通常伴随着糖型的变化,使得它成为许多疾病诊断的标志物。尽管许多功能糖已被开发成为保健品和药品,糖的奥秘依然没有被完全阐释,原因之一是结构明确糖链的制备复杂性导致其构效关系研究受到阻碍。因为糖链的复杂性,没有系统成熟的获得途径,利用糖基转移酶或糖苷酶等进行体外酶法合成是糖链制备的一种主要方式。糖核苷酸是单糖还原端的半缩醛羟基与核苷二磷酸或核苷一磷酸的末端磷酸基团连接形成的衍生物,是Leloir型糖基转移酶催化寡糖合成所必需的供体底物。由于繁琐的保护和脱保护步骤,化学合成糖核苷酸极具挑战性,随着补救途径中合成糖核苷酸的相关酶被克隆和表达,体外酶法合成糖核苷酸得到了广泛的应用。论文第二章利用发酵罐表达了糖核苷酸合成相关酶,合成了软骨素酶法合成所必需的两种糖核苷酸UDP-GalNAc、UDP-GlcA。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种具有硫酸化修饰的糖胺聚糖,由二糖重复单位以[-D-glucuronic acid-β1,3-N-acetyl-D-galactosamine-β1,4-]的方式组成。商品化CS由于其独特理化性质已经广泛应用到食品和药品等领域。近年来研究发现,CS不仅存在于细胞外基质,作为影响肺癌细胞转移、成骨细胞分化、神经元再生的信号分子发挥重要的功能,而且也是细胞表面的信息分子,通过与生长因子、细胞因子、趋化因子和粘附分子等受体蛋白相互作用调节生理过程。CS与重大疾病的关系密切,CS通过直接调节细胞功能或间接调节其效应分子,如生长因子或细胞因子的活性来参与肿瘤的发生发展过程。CS具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗感染等功效可以开发为具有更多功能的药物。更加重要的是,CS是细胞表面病原微生物的受体分子,在细菌粘附和感染中发挥重要作用,然而某些病原微生物表面荚膜成分含有软骨素多糖,借此分子伪装巧妙地逃避宿主细胞的免疫应答反应,如Escherichiacoli K4、Pasteurellamultocidatype F。目前,商品化CS主要是由动物组织提取获得,这种方法生产的CS结构差异大,原料生长周期长,且存在动物病毒感染的风险等。微生物发酵法生产软骨素产率低,产品纯化困难且有内毒素、核酸、蛋白质等污染。CS结构复杂特殊,化学合成极具挑战性。本论文围绕均一软骨素的制备,首先表达纯化了糖核苷酸合成相关酶类,研究了 UDP-GlcA和UDP-GalNAc两类糖核苷酸的酶法合成,为后续的研究奠定物质基础,之后,深入研究了 P.multocida F型菌株来源的软骨素合酶(PmCS)的催化反应机理,采用逐一法合成软骨素寡糖片段和一锅法同步化合成均一软骨素,开拓了均一软骨素糖链的两步偶联酶法合成策略。论文第二章,我们初步使用发酵罐对糖核苷酸合成相关酶进行发酵的探索。根据摇瓶表达蛋白的经验,放大到发酵罐中,对菌的生长规律和蛋白的表达条件进行摸索。我们表达了四种酶:AtGlcAK、AtUSP、BlNahK、AGX1,1 L培养液能够纯化获得 AtGlcAK 51 mg/L,AtUSP 26.88 mg/L,BlNahK 24 mg/L,AGX129 mg/L。随后我们用两步偶联酶法合成糖核苷酸的技术体系分别以38.36%的产率获得UDP-GlcA 89 mg,以43.2%的产率获得UDP-GalNAc 210mg。为软骨素的酶法合成提供了物质基础。论文第三章,我们首先选择使用C1位修饰的GlcA衍生物(GlcA-pNP和GlcA-N3)作为软骨素寡糖的合成起始底物,当以GlcA-pNP起始合成软骨素四糖后,分别以 G1cA-pNP、CH2-pNP、CH3-pNP、CH4-pNP 作为受体底物,以 UDP-GalNAc 和 UDP-GlcA 作为供体底物,通过改变受体/供体的化学计量比例,制备了系列软骨素糖链。但是,当以GlcA-N3起始合成软骨素寡糖时,未获得CH2-N3。随后研究了起始单糖受体对PmCS催化合成软骨素二糖的影响,发现PmCS以GalNAc为受体底物、UDP-GlcA为供体底物合成软骨素二糖的速率和转化率都大于以GlcA为受体底物、UDP-GalNAc为供体底物合成软骨素二糖的速率和转化率。基于这个结论,我们选择使用C1位修饰的GalNAc衍生物(GalNAc-N3)作为软骨素寡糖的合成起始底物,随着GlcAβ1-3GalNAcα(β)-N3两种二糖衍生物相继被合成、分离纯化后做NMR分析,证明无论是α构型linker还是β构型linker对糖基转移酶PmCS的影响可以忽略不计。在PmCS合成软骨素糖链的速度研究方面,发现PmCS在以不同长度寡糖受体为起始底物催化新生软骨素糖链的合成过程中存在起始限速步骤,以三糖为受体合成软骨素糖链的速度要远远快于以单糖为受体合成糖链的速度。在PmCS合成软骨素的均一性研究方面,发现软骨素三糖是PmCS催化合成均一软骨素多糖所必需的最小受体底物;进一步研究发现,在酶量充足、反应时间充足的情况下,反应体系中受体/供体摩尔浓度比例是影响软骨素糖链长度的关键因素,通过对反应体系的化学计量控制,完成了均一软骨素糖链长短可控的体外酶法合成。