液体活检中细胞外囊泡的溯源及肿瘤检测应用研究

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肿瘤是当代人生命健康的重要威胁。研究表明肿瘤的及时的、早期的检测可以极大的改善肿瘤的治疗效果。液体活检是肿瘤检测的理想范式之一,它仅需要微量的生物样本就能准确地反映出肿瘤的状况,具有成本低廉、低侵入性的优点。细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EV)在体液中大量存在,对其表面携带的生物分子的分析可以检测肿瘤的状况,是液体活检的理想对象。然而,由于健康细胞和肿瘤细胞都能够产生EV,肿瘤EV的信号被健康EV所掩盖,因此需要建立一种方法区分肿瘤EV和健康EV;其次,现有的EV的液体活检手段大都依赖大型仪器和专业人员,因此急需建立一种廉价、迅速、可靠的、能够满足即时检验(point-of-care testing,POCT)要求的肿瘤EV检测手段。本文中,我们依托机器学习,首先建立了一种通用的EV溯源手段,实现了肿瘤EV和非肿瘤EV的分离;其次我们实现了EV表面的DNA计算和信号输出,实现了满足POCT要求的EV液体活检。论文主要内容如下:第一章绪论本章主要介绍了液体活检的概念,以及在肿瘤检测中的应用。同时对其目前所存在的问题进行了分析,对其前景进行了展望。同时,我们介绍了EV的生物发生过程、生物功能及临床应用。在此基础之上我们对工作的研究意义和内容进行了阐述。第二章利用免疫荧光实现单EV溯源本章利用免疫荧光技术半定量的检测单个EV的膜蛋白丰度,以全内反射荧光显微镜(TIRFm)和机器学习为手段实现了EV的溯源。本章中我们首先利用梯度离心分离EV并对其进行了表征。之后我们利用抗体和EV表面膜蛋白的特异性相互作用将EV吸附于界面上,并以荧光修饰的Anti-CD63和Anti-CD9的荧光抗体对EV进行了成像,荧光强度可以半定量的反映对应的蛋白表达丰度,我们利用人工智能手段对这些荧光强度进行了特征分析,实现了临床EV的溯源。第三章EV表面的DNA处理器模块用于肿瘤检测本章中我们利用DNA实现了EV表面膜蛋白的识别,并将识别结果进行了可视化的输出,用以实现癌症检测。我们首先利用界面捕获EV,用包含适配体序列的DNA进行修饰,识别EV中HER2+/Ep CAM+的亚群用以检测乳腺癌,识别EV中PSMA+/Ep CAM+的亚群用以检测前列腺癌。我们后续利用酶促显色反应对运算结果进行信号放大和输出,并借助智能手机和人工智能方法实现了乳腺癌和前列腺癌的检测。
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