DNA是细胞内最主要的遗传物质，其三维结构对细胞内DNA复制和RNA转录等生理活动有非常大的影响。因此，研究DNA的拓扑结构形式及其包装方式具有非常重要的意义。本论文对环形质粒DNA的特殊拓扑结构和特性以及其生物学意义作了广泛深入的研究，得到了一系列有价值的结果。 (1)本课题首次使用原子力显微镜研究了超螺旋质粒DNA(pUC18、pACYC184、pJGX15A)的碱变性结构。结果显示质粒DNA碱变性结构(FormⅣ)与超螺旋DNA分子(Form Ⅰ)的结构相差很大，DNA链高度卷曲，包含很多纽结(node)。比较碱变性质粒DNA分子与超螺旋DNA分子的长度和高度，结果显示，碱变性超螺旋质粒DNA分子的高度却与超螺旋DNA分子的高度相似。然而，碱变性质粒DNA分子的长度要明显短于超螺旋DNA分子，但是不同质粒变性后的长度变化是不同的---pUC18缩短了30％，pACYC184缩短了16％，pJGX15A缩短了50％。 本课题使用限制性内切酶和DNA拓扑异构酶处理质粒pBR322变性DNA，并用原子力显微镜观察其结构。结果显示，限制性内切酶PstI可以对碱变性pBR322超螺旋DNA 产生作用，使其在琼脂糖凝胶电泳中表现为类似于“smear”的条带，而且其迁移率比碱变性超螺旋DNA的条带相对低一些。原子力显微镜照片显示，PstI处理的碱变性超螺旋DNA分子都产生了游离末端以及分子内打结(knot)，而且结的大小不均一。此外，研究结果还表明拓扑异构酶Ⅳ的处理使碱变性的pBR322 DNA在电泳中表现为类似“smear”的条带。原子力显微术结果证实，拓扑异构酶Ⅳ在变性超螺旋DNA内形成分子内打结。这种结构与PstI处理形成的结构非常相似。 本课题还展示了环形和线性单链DNA分子的构象。原子力显微镜照片显示，单链环形DNA分子并不是松弛的，而是含有一个很明显的高度凝集的部分；单链线性分子也不是平滑的，其末端同样含有高度凝集的部分。 (2)本课题用温和的方法提取大肠杆菌topA 细胞DM800中质粒DNA，并对其中的超凝集结构进行了研究。结果表明，超凝集pBR322 DNA的形成可能与拓扑异构酶Ⅰ无关而与旋转酶的突变有关。本课题还发现，拓扑异构酶Ⅰ和旋转酶对超凝集结构没有作用；然而拓扑异构酶Ⅳ不仅可以将普通超螺旋DNA完全松弛，也将超凝集DNA完全松弛。原子力显微镜照片显示超凝集DNA分子都呈松弛的环状不含有超螺旋结构，但DNA双链不平滑，在分子内多处形成纽结，这种分子内纽结的形成有可能消解了分子内的扭力；超凝集DNA分子的长度比普通超螺旋DNA分子的长度缩短了接近30％，超凝集DNA分子的宽度和高度却都比普通超螺旋DNA分子有了明显的增加(约60％)。此外，超凝集pBR322DNA分子对氯喹的反应也相当特殊(图3．4D)：所有的分子都在分子内形成了结，而且缠绕的相当紧密，有些分子甚至压缩成一团(图3．4D中箭头所示)。本课题对HB101细胞中的质粒DNA样品进行了分析和研究，并且发现了三种特殊结构。特殊结构Ⅰ在各种抗生素处理的细胞中普遍存在，似乎这种结构的形成与细胞的生长受到抑制有关。透射电子显微镜结果表明，pBR322特殊结构Ⅰ分子的构象中不具有超螺旋特征，但是都至少含有一个分子内的结(knot)：这个结将DNA分子分割成不同的环形区域，这些环形区域都是独立的区域，形成“花瓣”样的构象。结果还表明，特殊结构Ⅰ在电泳行为和分子的尺寸上都与前文所描述的超凝集结构十分相似。特殊结构Ⅱ和Ⅲ在质粒DNA样品中的含量非常少，同时发现旋转酶的活性与两种特殊结构的形成有关，而特殊拓扑结构Ⅲ形成还与转录有关。原子力显微镜结果显示，pBR322特殊结构Ⅱ分子的构象中同样不具有超螺旋特征，但是也含有分子内的结(knot)；这个结的位置都靠近环形分子的一端，其特征就是每个分子都被分隔出一个大小相近的小的环形区域，似乎结就是围绕这个小环形成的。特殊结构Ⅲ仍然保持着超螺旋结构的特征，只是分子内的DNA链凝集的比较紧密，有的甚至被压缩成一团。 (3)本课题发现pJGX15A在宿主HB101中的负超螺旋水平明显要高于在宿主DM800中的负超螺旋水平。同时，菌落免疫酶斑检测的结果显示，重组菌株HB101(pJGX15A)和DM800(pJGX15A)都可良好表达并分泌CFA/Ⅰ抗原，但是重组菌株HB101(pJGX15A)CFA/Ⅰ的表达量明显低于DM800(pJGX15A)CFA/Ⅰ的表达量。结果表明细胞DNA的负超螺旋水平与CFA/Ⅰ基因表达呈负相关性。 本课题还研究了长转录单位tetA-cfaABCE的转录对质粒拓扑结构的影响。结果表明，质粒pJGX15A在DM800中形成了一种新的不规则凝集结构。这种不规则凝集结构只出现在DM800对数生长期细胞中，并且当四环素浓度达到12μg/ml时，不规则凝集结构不能形成。原子力显微镜照片显示，这种不规则凝集结构的DNA分子表现出很高的多态性。几乎所有的DNA分子都包含有不同程度的高度凝集的部分，甚至一些DNA分子完全压缩成了一团。推测这种不规则凝集结构的生成依赖于高速的转录。 (4)本课题构建了一系列质粒并将它们转化到大肠杆菌细胞中，以此来研究LacI的结合对质粒DNA拓扑结构的影响。结果表明，在野生型大肠杆菌细胞DM4100中，当细胞中含有LacI蛋白时，LacI蛋白的结合也可以促使质粒DNA形成高度负超螺旋结构。对于这种高度负超螺旋结构的形成，tetA基因的转录是必需的。而且，这种高度负超螺旋结构的形成是依赖于转录和旋转酶的作用的。 为了进一步研究LacI蛋白的结合对质粒DNA拓扑结构的影响，将质粒pJY183、pJY184、pJY188以及pJY185共转化到大肠杆菌DM800(topA gyrB225)中。结果表明，当大肠杆菌DM800细胞培养到静止期时，质粒pJY183、pJY184以及pJY188的超螺旋水平都有很大程度的下降，同时高度负超螺旋结构也随之消失，但当静止期细胞重悬于新鲜培养基中培养时，质粒DNA的超螺旋水平很快恢复。然而，当静止期细胞在加入萘啶酮酸的新鲜培养基中培养时，质粒pJY183、pJY184和pJY188 DNA的超螺旋水平稍微有所上升，而且pJY183和pJY188的高度负超螺旋结构也重新形成，但是pJY184的高度负超螺旋结构却无法重新形成。由此可见，大肠杆菌DM800细胞中LacI结合在tetA基因上游使质粒DNA高度负超螺旋结构的形成对旋转酶的依赖性有所下降，而LacI结合在tetA基因下游则对质粒DNA高度负超螺旋结构的形成影响不大。