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脑小血管病（Cerebral small vessel disease,CSVD）即指血管危险因素作用在脑小血管上所导致的一系列病理、影像和临床表现。在众多血管危险因素中,高血压是目前已知的最明确和最主要的危险因素。多项研究认为,诱发CSVD的主要原因包括内皮细胞损伤和血脑屏障渗漏。高血压相关的非淀粉样脑血管病变和淀粉样脑血管变性（Cerebral amyloid angiopathy,CAA）是最为常见的两大CSVD类型。值得注意的是,这两种主要的CSVD亚型有各自的病理、临床和影像学诊断标准,然而它们在潜伏期阶段却有相同的发病原因,提示很可能存在共同的早期病理机制促使CSVD的发生发展。目前,具体有哪些上游分子参与了发病过程还并不清楚。本实验室的前期工作以及其它科研团队均发现,在有脑小血管损伤的CAA病人脑血管中,β-分泌酶（BACE1）出现表达上调的现象,而其蛋白水平在高血压相关的非淀粉性CSVD中是否也出现异常变化还没有任何报道。在本次研究中,我们首先通过免疫印迹实验检测到在高血压病人脑中,分离出的微血管含有的BACE1蛋白水平相比于血压正常的对照组上升到约3.71倍。同时,免疫荧光结果显示,高血压相关的非淀粉性CSVD患者脑中微血管内皮上的BACE1阳性面积相比于血压正常的对照组增加到约2.05倍。这些结果提示我们脑小血管源BACE1的异常变化有可能是参与不同类型脑小血管损伤发生的共同事件。值得注意的是,不管是免疫印迹实验还是免疫荧光实验都显示,处于高血压状态下的微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白occludin减少了约40.16%～47.59%。更为重要的是,数据分析显示微血管上BACE1的上调和occludin的减少呈负线性相关,说明微血管源BACE1有可能通过紧密连接蛋白occludin来影响脑小血管的状态和功能。在探索这些现象对应机制的过程中,我们首先发现occludin是BACE1的一个全新酶切底物,BACE1对occludin的切割能够导致occludin全长减少,同时产生occludin的N端和C端片段。同期实验结果显示,BACE1并不会酶切紧密连接结构的其它重要组分蛋白如ZO-1、JAM-A和claudin-1,然而BACE在内皮细胞中蛋白水平的升高能够导致这些非底物的紧密连接蛋白减少。我们进一步探索发现,其原因在于上调表达的内皮细胞源BACE1会大量切割occludin从而引起紧密连接结构不稳定,促使窖蛋白caveolin-1在内皮细胞质膜上聚集,导致组成紧密连接结构的其它膜蛋白如JAM-A和claudin-1进入caveolin-1介导的内吞途径,最终在溶酶体中降解,而胞质紧密连接蛋白如ZO-1则被胞质酶降解。同时,在质膜上富集的caveolin-1与内皮型一氧化氮合成酶（endothelial isoform of nitric oxide synthase,eNOS）结合增多,从而直接抑制了 eNOS向胞质的转移以及随后的磷酸化激活,导致eNOS活性下降和其下游信号丧失引起的内皮细胞功能障碍。除了新发现的底物occludin,内皮细胞也会表达另一个已知的BACE1底物淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）。BACE1切割APP也会导致APP全长减少而其最终酶切产物β-淀粉样多肽（β-amyloid peptides,Aβ）则会释放到细胞外。Aβ已被证明可以影响血管内皮细胞的状态和功能,为检测内皮细胞源BACE1上调是否会通过Aβ产生增多诱发CSVD早期事件,我们用Aβ刺激人源和鼠源内皮细胞,发现人源和鼠源Aβ1-40和Aβ1-42都能显著抑制两种内皮细胞中eNOS活性。以上体外实验说明,在内皮细胞中上调表达水平的BACE1会同时过度切割其底物occludin和APP,通过BACE1-occludin和BACE1-APP-Aβ这两条通路导致内皮细胞紧密连接丢失和eNOS失活引起的功能障碍。为进一步在体检测上述机制及其是否能引起类似于临床的CSVD病理和行为表型,我们新构建了一种由血管内皮启动子Tie2控制并在血管内皮细胞中高表达人源BACE1约5.11倍的转基因小鼠VE-BACE1。与同龄WT小鼠相比,在9月龄VE-BACE1小鼠脑中即出现重要紧密连接蛋白occludin、ZO-1、JAM-A和claudin-1丢失、血浆中Aβ1-40和Aβ1-42浓度显著升高和活化形式eNOS水平减少。这些早期事件导致VE-BACE1小鼠在12月龄出现脑内低灌注,在15月龄出现血脑屏障渗漏,且这些现象随年龄增大而加剧。此外,VE-BACE1小鼠在15月龄即表现出微出血、运动能力减退和认知能力下降等CSVD的病理以及行为特征。反之,用BACE1抑制剂MK-8931抑制异常过高的BACE1活性后可以显著改善VE-BACE1小鼠脑中紧密连接蛋白丢失、eNOS功能障碍和记忆损伤,且对15月龄WT和VE-BACE1小鼠用低浓度持续处理3个月后,未观察到不良反应和死亡现象。以上所有结果表明,血管内皮细胞源BACE1的蛋白水平与脑小血管损伤之间存在直接关系,即受血管危险因素如高血压影响而异常上调的内皮细胞源BACE1通过对其底物occludin和APP的过度切割,导致内皮细胞间紧密连接结构减少和eNOS功能减弱这两个早期致病事件。在这一过程中,血管内皮细胞从正常生理状态向损伤表型转变,并进一步导致下游脑小血管病的发生发展和行为改变。综上所述,内皮细胞源BACE1的表达上调是CSVD发生发展的一个重要早期机制,而靶向高表达BACE1的异常内皮细胞有可能是治疗CSVD的早期重要方案。