精原干细胞（SSCs）是雄性动物体内唯一能向子代传递遗传信息的成体干细胞，其增殖与分化的每个环节都可能影响生物个体的生殖能力或育性，潜在的生物学意义使其成为科学研究的热点。大量研究证实，胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，gdnf）是介导哺乳类（特别是啮齿类） SSCs自我更新与维持的关键因素，同时也是体外细胞长期培养的必需因子。在硬骨鱼类，gdnf目前仅在虹鳟（Oncorhyncus mykiss）中进行了分离鉴定，其mRNA表达于精巢生殖细胞，并且mRNA表达水平与SSCs的自我更新过程密切相关，提示在非哺乳类动物中Gdnf可能同样介导了SSCs的自我更新与维持，但具体如何，尚待研究。　　另一方面，不少研究者通过在培养基中添加多种生长因子如碱性成纤维生长因子(bFGF)、白血病抑制因子（Lif）、Gdnf以及鱼血清、胚胎提取物等，进行了鱼类SSCs体外培养的相关研究，但除青鳉（Oryzias latipes）外，目前仅建立了短期或原代SSC培养体系。Hong等用含鱼血清、自身胚胎提取物、人重组bFGF的条件培养基成功建立了一株成年青鳉精巢细胞来源的精原干细胞系SG3，同时也是迄今唯一的硬骨鱼类SSC细胞系，SG3表达多个生殖细胞特异分子如dazl、piwi、vasa，在培养体系中能完成整个减数分裂过程，并产生有活力的精子。目前。SG3在体外培养已达140代以上，依然能稳定增殖。遗憾的是，Gdnf是否介导了SG3的自我更新与维持，目前尚不清楚。　　鉴于此，本研究以青鳉、罗非鱼（在本研究中如未特殊说明，均指尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus））为研究对象，主要开展了以下两方面工作：一是获得并鉴定了青鳉与罗非鱼gdnf的cDNA序列，并对其在胚胎发育不同时期及不同组织中的mRNA表达水平进行了检测；二是构建pET30a原核表达载体，获得了纯化的Gdnf重组蛋白，通过EdU标记、CCK-8与定量PCR检测，结果表明Gdnf重组蛋白能促进SG3的增殖，并上调bcl6b的表达。具体结果如下：　　1. gdnf的cDNA序列与分析　　经RT-PCR、测序分析，分别从青鳉、罗非鱼成功获得了具有2种不同基因编码的gdnf cDNA序列，分别命名为Olgdnfa与Olgdnfb；Ongdnfa与Ongdnfb。Olgdnfa与Olgdnfb分别编码253、245个氨基酸；Ongdnfa与Ongdnfb分别编码257、271个氨基酸。Gdnfa/b通过蛋白酶的水解形成成熟蛋白，其C端具有TGF-β家族成员的典型序列特征，即7个保守的半胱氨酸，成熟蛋白与哺乳类氨基酸一致度达50％以上，其中TGF-β结构域高达65%以上，提示Gdnfa/b在不同物种中可能均具有保守的生物学功能。氨基酸一致度、基因共线性及系统进化分析结果均表明，青鳉、罗非鱼gdnfa与哺乳类具有更近的亲缘关系。　　2. gdnf在胚胎发育不同时期及各组织中的mRNA表达　　RT-PCR检测结果显示，青鳉、罗非鱼gdnfa与b均表达于胚胎发育不同时期，及包括精巢在内的多种组织。在青鳉中，除眼外，gdnfa在各组织表达水平均高于gdnfb；在罗非鱼中，gdnfa在各组织均有较高水平的表达，gdnfb在垂体、鳃、肝脏和头肾表达较高，在其他组织表达水平较低。　　3青鳉gdnfa与b的原核表达、纯化　　成功构建了青鳉 gdnfa与 b的含 His标签的原核重组表达载体，即pET30a-Olgdnfa与pET30a-Olgdnfb，转化BL21(DE3)表达菌株，通过IPTG诱导表达OlGdnfa/b蛋白，之后通过亲和层析(Ni-IDA树脂)进行纯化，获得了OlGdnfa/b重组蛋白，其纯度大于85%。　　4青鳉Gdnfa与b的生物学活性　　(1)用分别含1、10、50 ng/ml青鳉Gdnfa与b的DMEM条件培养基（含L-glutamine(2 mM)。Na-pyruvate(1 mM)。Na-selenite(2 nM)。non-essential amino acids(1 mM)、2-mercaptoethanol(50 PM)，命名为5N）培养SG3于96孔板，对照组为不含Gdnf的5N培养基，分别于1、4、5、6 d后，用CCK-8检测细胞的增殖活性，结果显示1、10、50 ng/ml Gdnfa与 b均能促进SG3细胞增殖；此外，用EdU标记检测细胞增殖，结果显示，含有Gdnf的5N培养基内EdU的阳性细胞明显高于对照（p<0.05)。从而表明，Gdnfa与 b均能促进SG3细胞增殖。　　(2)用5N培养基培养SG318 h后，分别加入50 ng/ml的青鳉Gdnfa或b，4 h后收集细胞，半定量RT-PCR检测bcl6b与etv5的mRNA表达水平，结果显示。bcl6b的mRNA水平显著升高，而etv5的mRNA表达水平未见明显变化，qPCR检测结果与此相吻合。bcl6b是哺乳类Gdnf调控的重要靶基因，在SSCs自我更新与维持中具有重要作用。该研究结果表明，青鳉Gdnf调控SSCs自我更新与维持的靶基因在脊椎动物中具有高度保守性。　　该研究将推进我们对于Gdnf在SSCs自我更新与维持中作用及其机制的进一步认识，并且可为我们今后鱼类SSCs体外培养体系建立提供理论依据与重要参考。