BRG1调控自噬对终末期肾脏病血管钙化的作用机制

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研究目的:血管钙化(Vascular calcification,VC)是慢性肾脏病(CKD)患者常见的临床表现之一。但是,目前尚无可靠的早期生物标记物,这给血管钙化的防治带来了困难。我们通过Label-free蛋白质组学在高磷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)模型中筛选出具有显著差异表达的分子BRG1。BRG1又叫Smarca4,是SWI/SNF复合物的核心催化亚基,它通过改变基因周围的染色质结构来调节这些基因的转录活性,并调控细胞周期、增殖和分化,但其在血管钙化中的作用尚不清楚。鉴于此,本研究将观测BRG1在血管钙化中的表型,着重阐释BRG1影响血管钙化的可能机制,为寻找血管钙化早期生物标记物打下基础。研究方法:1.构建高磷诱导的RASMCs钙化模型,用Von-Kossa染色、RT-PCR和Western blot实验筛选最佳的建模条件。2.对正常和钙化RASMCs进行Label-free蛋白质组学检测,筛选具有差异表达的蛋白质。3.对BRG1的表达进行体内验证。构建终末期肾脏病(ESRD)血管钙化动物模型,并收集临床ESRD血管钙化患者和正常人的动脉血管组织,RT-PCR和免疫组织化学染色(IHC)验证BRG1的表达。4.探讨BRG1通过自噬影响RASMCs钙化的机制。不同自噬处理剂诱导或抑制RASMCs自噬,激光共聚焦(Laser Confocal)及Western blot观察不同处理条件下RASMCs的自噬活性和钙化程度。用siRNA敲减BRG1,通过Von-Kossa染色、RT-PCR和Western blot观察BRG1下调后RASMCs的钙化程度及自噬活性。研究结果:1.高磷成功诱导RASMCs发生钙化。2.Label-free蛋白质组学共筛选出113个差异表达蛋白,其中BRG1在钙化组中表达增加且差异显著。3.BRG1在ESRD血管钙化大鼠和患者的血管组织中表达明显增多,与蛋白质组学筛选结果一致。4.Confocal及Western blot的结果表明,RASMCs钙化后自噬活性增强。饥饿和Rap能增强自噬活性,3-MA和HCQ能抑制自噬活性,敲减BRG1能减弱RASMCs的自噬活性及钙盐沉积和钙化相关指标的蛋白表达量。研究结论:我们通过Label-free蛋白质组学在钙化RASMCs中筛选出表达上调的BRG1,在ESRD血管钙化患者、血管钙化大鼠模型和钙化RASMCs模型也验证了BRG1的表达均呈增加的趋势。敲减BRG1表达后发现钙化细胞的自噬活性减弱,钙化程度减轻。因此,我们认为BRG1可能通过影响RASMCs的自噬活性从而调控RASMCs钙化的发生发展。
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